醋制對南五味子抗CCl4致急性肝損傷大鼠的影響

姜海慧，張 婷，張化為，姜 祎，宋小妹，2，黃文麗，鄧 翀*

（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046）

南五味子為木蘭科華中五味子（Schisandra sphenantheraRehd.et Wils）干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，用于治療久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、津傷口渴、內熱消渴及心悸失眠等［1］。據文獻報道，南五味子對肝損傷保護和修復研究較多［2-4］。在“醋制入肝”［5］中藥炮制理論指導下，本研究以CCl4致大鼠急性肝損傷為模型，比較南五味子醋制前后對肝臟保護和肝損傷修復差異，為探討醋制南五味子修復肝損傷原理提供依據和參考。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

南五味子采購自陜西省商洛市商州區，經陜西中醫藥大學藥學院姜祎副教授鑒定為木蘭科華中五味子的干燥成熟果實。聯苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團股份有限公司，1.5 mg/丸，批號20190724）。CCl4（成都科龍試劑廠，純度≥98%，批號20190724）；烏來糖（中國國藥集團化學試劑有限公司，純度≥98%，批號WS20170411）；其余試劑均為分析純。ALT（批號20190510）、AST（批號20190822）、MDA（批號20190912）、GSH（批號20190506）、SOD（批號20190423）、HE（批號20190713）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；HIF-1α（批號60441）、NF-κB p65（批號07C14B）均購自武漢生物工程有限公司；米醋（山西水塔老陳醋股份有限公司，批號20190602）。

1.2 試驗動物

SD大鼠，雌雄各半，7～8周齡，清潔級，體重200±20 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號SCXK（陜）2019-010，實驗動物通過陜西中醫藥大學倫理委員會批準，飼養和實驗操作均符合動物實驗管理條例的要求。

1.3 主要儀器

UV1102紫外分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；GB2042電子天平（賽多利斯貿易有限公司）；RE52-05旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）；ELX-808型自動酶標儀（美國寶特公司）。

2 方法

2.1 供試樣品制備

分別稱取醋制前后南五味子粉末各2 kg，以16倍體積55%乙醇回流提取2次，提取時間60 min。旋轉蒸發儀減壓濃縮提取液，濃縮浸膏經烘箱60℃干燥，最后得到干膏。分別稱取一定量南五味子醋制前后醇提取物，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液溶解，制備不同給藥劑量灌胃藥液。

2.2 實驗方案

將90只SD大鼠隨機分為9組，每組10只，分別是空白對照組（CMC-Na溶液），模型對照，陽性對照組（聯苯雙酯滴丸，3.75 mg/kg），醋制前五味子大、中、小劑量，醋制后五味子大、中、小劑量（各組的給藥劑量以生藥量計算分別為5 g/kg體重、2.5 g/kg體重、1.25 g/kg體重）。正常對照組和模型組用等體積的0.5%CMC-Na溶液灌胃，每日1次，共10 d。末次給藥后2 h，正常對照組除外，其余各組腹腔注射1 mL/kg CCl4。另外空白對照組和模型組組給予相應劑量的CMC-Na溶液，陽性對照組給藥劑量為100 mg/kg。

2.3 組織標本的采集及處理

造模后大鼠禁食不禁水12 h后，腹主動脈取血并靜置1 h，以3000 r/min離心10 min，分離血清，-80℃的冰箱中保存備用。取動物的肝臟組織（均取同一部位），以適量生理鹽水清洗血污，部分肝組織于-80℃貯存備用待測，部分肝組織以10%甲醛固定。參照試劑盒說明測定血清中AST、ALT活力；參照試劑盒說明測定不同實驗組別肝臟中的GSHPx、MDA、SOD含量；甲醛固定肝組織，HE染色組織形態學觀察；免疫組化染色（結合生化指標和一般病理切片實驗結果，免疫組化染色只針對大劑量組），觀察染色表達情況。

2.5 統計學處理

以SPSS25.0軟件分析數據，以不同觀察的實測值進行組間比較，以P＜0.05表示組間具有顯著差異性，以P＜0.01表示組間具有非常顯著差異性。

3 結果

3.1 藥物對四氯化碳致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST含量的影響

與對照組相比，模型組中ALT和AST水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較聯苯雙酯組、炮制前高劑量組及醋制后低、中、高劑量組中ALT和AST水平顯著降低（P＜0.01），醋制前中、低劑量組中ALT和AST水平降低（P＜0.05）；與醋制前大劑量相比，空白組、聯苯雙酯組、醋制后大劑量組、醋制后中劑量組、聯苯雙酯組中ALT和AST水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），但醋制后高劑量組與聯苯雙酯組差異不明顯。結果見表1。

表1 南五味子醋制前后對CCl4致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST含量的影響Table 1 Effects of S.sphenanthera vinegar on serum ALTand ASTlevels in rats with acute liver injury induced by CCl4

3.2 藥物對動物肝臟中GSH-Px、MDA、SOD含量影響

與對照組相比，模型組中GSH-Px、SOD水平顯著降低（P＜0.01），MDA水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，聯苯雙酯組、醋制前低、中、高劑量組及醋制后低、中、高劑量組中GSH-Px、SOD水平顯著升高（P＜0.01），MDA水平顯著降低（P＜0.01）；與醋制前大劑量相比，空白組、醋制后大劑量組中GSHPx、SOD水平顯著升高（P＜0.01），但炮制后高劑量組與聯苯雙酯組差異不明顯。結果見表2。

表2 南五味子醋制前后對大鼠肝組織中SOD、GSH及MDA的影響Table 2 Effects of S.sphenanthera vinegar on SOD，GSH and MDA in liver tissues of rats

3.3 藥物對大鼠肝組織病理學變化影響

醋制南五味子對大鼠肝組織病理學變化影響結果見圖1。如圖1A所示，在組織形態學光鏡下，空白對照組肝細胞邊緣完整，排列規則；如圖1B所示，模型組肝組織病變明顯，肝小葉結構存在，各動物均見以小葉中心為主的不同程度的肝細胞空泡變性及氣球樣變，重者其間見肝細胞壞死表達，且雌性組比雄性組更為嚴重；如圖1C所示，南五味子給藥組及陽性對照組與模型組相比，肝組織病變明顯減輕，其中陽性對照5只動物恢復正常，4只仍有輕微損傷，未見重度損傷的病理改變，這表明陽性藥聯苯雙酯抗肝損傷效果明顯；圖1D至1I表明醋制五味子各劑量給藥組對肝組織病變改善程度明顯優于其生品各劑量組，醋制南五味子各給藥劑量組對肝組織病變改善程度以高劑量組最為明顯。

圖1 醋制南五味子對CCl4致急性肝損傷肝臟組織形態學圖Fig.1 Histomorphology of the liver histomorphology of the acute liver injury induced by CCl4 caused by vinegar-made S.sphenanthera

3.4 藥物對大鼠肝組織NF-κBp65蛋白表達水平的影響

醋制五味子對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織NF-κB免疫組化結果的影響如圖2所示。結果表明，NF-κBp65免疫反應陽性細胞多存在于肝靜脈周圍，棕黃色陽性染色顆粒主要表現在細胞核；圖2A表明正常組染色未見免疫反應陽性細胞；圖2B表明模型組陽性細胞染色加深，陽性表達分布密集；圖2C表明生品組陽性細胞數目減少及染色變淺，陽性表達稀疏分布；圖2D表明醋制南五味子組陽性棕黃色顏色較淺，少有分布。由此可見，南五味子對大鼠損傷肝組織中NF-κBp65蛋白表達具有調節作用，其中醋制南五味子對NF-κB p65蛋白表達調節強于南五味子生品。

圖2 大鼠肝臟NF-kBp65蛋白免疫組化圖Fig.2 Immunohistochemical map of NF-kBp65 protein in rat liver

3.5 藥物對大鼠肝組織HIF-1α蛋白表達水平的影響

醋制五味子對CCl4致急性肝損傷大鼠肝組織HIF-1α免疫組化結果的影響如圖3所示。圖3A表明正常對照組的小鼠肝臟HIF-1α表達陰性，整體顏色較淺；圖3B表明CCl4急性肝損傷組小鼠肝臟HIF-1α主要在肝靜脈周圍損傷細胞中有強陽性表達，整體棕黃色表達顏色較深；圖3C表明南五味子生品預處理組肝臟HIF-1α陽性的細胞數量相比模型組陽性表達顯著減少，主要分布在肝靜脈周圍細胞有顯著減少；圖3D表明醋制五味子預處理組肝臟HIF-1α陽性的細胞數量相比模型組陽性表達減少，棕黃色陽性表達顏色很淺，主要分布在肝靜脈周圍細胞。可見，南五味子對大鼠肝組織HIF-1α蛋白表達具有調節作用，其中醋制南五味子對調節能力優于南五味子生品。

圖3 大鼠肝臟HIF-1α蛋白免疫組化圖Fig.3 Immunohistochemical map of HIF-1αprotein in rat liver

4 討論

CCl4在肝細胞P450酶系作用下產生一系列自由基從而引起氧化應激及脂質過氧化的連鎖反應，損傷細胞膜的結構和功能，導致肝細胞壞死［6-7］。當機體內氧自由基的動態平衡被打破，產生過多的自由基，抗氧化物質SOD、GSH等被大量損耗，從而形成脂質過氧化反應的終產物MDA［8-9］。MDA的水平可反映機體內脂質過氧化的程度，并可以反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。血清中ALT、AST水平反映了肝細胞受損的程度［10］，因此本研究選用ALT、AST指標來反映肝損傷。

另一方面，HIF-1α是調節氧穩態平衡的主要調節因子，HIF-1α缺氧感受途徑通過不同的機制在不同的環節直接或間接參與了對免疫反應的調控，并且在此過程中發揮了重要的作用。在缺氧條件下可能存在“炎癥-炎性介質-HIF-1α-炎癥”的正反循環，HIF-1α起著炎癥放大的作用［11］。核因子-κB（NF-κB）通路在各種因素導致的急性肝損傷過程中扮演了重要的角色［11-12］。HIF參與組織/細胞中氧含量變化介導各種生理/病理變化的調節，HIF-1α能夠激活與無氧酵解相關基因p53的表達；而NF-κB在多種細胞類型中也能應答缺氧而被激活，從而進一步參與組織/細胞中對炎癥的調控。NF-κB調控HIF因子的轉錄，而HIF-1α調節NF-κB信號的轉導。HIF-1α和NF-κB在缺氧性炎癥中具有緊密的相互依賴性調控作用［13-14］。

本研究結果表明，南五味子醋制前后均能降低CCl4致小鼠急性肝損傷血清ALT、AST的升高，降低肝勻漿中MDA含量，增強GSH-Px、SOD的活性，抑制肝細胞中NF-KBP65和HIF-1α表達，減輕CCl4對肝組織的病理損傷。其中，醋制南五味子對大鼠體內ALT、AST、GSH-Px、SOD紊亂狀態調節更為明顯，在抑制肝細胞中NF-KBP65和HIF-1α表達和減輕CCl4對肝組織的病理損傷效果更為顯著。醋制過程增強了南五味子對CCl4致大鼠機體氧化應激及脂質過氧化狀態的調節，這為進一步闡明醋制南五味子降酶保肝的作用機理提供實驗依據。