如何減少冷凍切片中的類冰晶現(xiàn)象

林興滔，葛 巖，鄧雪琴，郭壽銘，李 智

術(shù)中冷凍切片快速病理診斷是協(xié)助臨床醫(yī)師明確病變性質(zhì)、指導(dǎo)手術(shù)方式和范圍的重要依據(jù)。由于冷凍切片技術(shù)、取材范圍有限和報告時間短等問題，易導(dǎo)致病理醫(yī)師延遲診斷，甚至是誤診。高質(zhì)量的冷凍切片是病理醫(yī)師準(zhǔn)確發(fā)出術(shù)中快速病理診斷的基礎(chǔ)。筆者在臨床實踐操作中觀察到部分冷凍切片組織結(jié)構(gòu)扭曲、細(xì)胞擠壓變形，存在類冰晶現(xiàn)象，而冰對組織石蠟切片中未見此類現(xiàn)象。本實驗旨在探討切片類冰晶現(xiàn)象產(chǎn)生的原因及解決方法，以進(jìn)一步提高冷凍切片的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年8月廣東省人民醫(yī)院病理科行術(shù)中冷凍切片病理診斷標(biāo)本30例，包括甲狀腺、乳腺、肺、腦、肝臟、卵巢和淋巴結(jié)組織。

1.2 儀器與試劑德國Leica CM1960恒溫冷凍切片機(jī)，全自動冷凍染色機(jī)，OCT冷凍包埋劑，電冷熱吹風(fēng)筒(1 kw)，冷甲醇50 mL，Lillie-Mayer蘇木精，水溶性伊紅Y，1%碳酸鋰溶液，耐確冷凍染色機(jī)NQ200S。

1.3 方法根據(jù)組織大小選取不同規(guī)格的夾頭，根據(jù)冷凍組織類型設(shè)置箱體溫度，使組織保持合適的硬度。將樣本支持器平穩(wěn)放置在速凍臺上，滴加少許OCT包埋劑讓其硬化，將規(guī)范取材(厚度≤3 mm)的術(shù)中冷凍新鮮組織放在其表面，用OCT包埋膠完全包裹，組織變硬后即可切片，6～8 μm厚[1]。實驗分成兩組：(1)人為冰晶組，新鮮組織塊浸泡于生理鹽水15 min后，不吸干水分直接冷凍切片。(2)實驗組，新鮮組織用紙巾吸干表面水分后冷凍切片。2組病例均冷凍切片8張，分別進(jìn)行4種不同操作方法處理：A.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后直接水洗，再行進(jìn)行性HE染色；B.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后冷風(fēng)吹干20 s，水洗后行進(jìn)行性HE染色；C.切片分別室溫自然晾干1、2、4、8和16 min，入冷甲醇固定1 min，水洗后行進(jìn)行性HE染色；D.切片后冷風(fēng)吹干20 s后入冷甲醇固定1 min，水洗后行進(jìn)行性HE染色。冷凍組織切片后置于10%中性福爾馬林固定24～48 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，包埋，4 μm厚切片，并行HE染色。

1.4 結(jié)果評估對切片整體、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、胞核染色質(zhì)及核質(zhì)比進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

人為冰晶組冷凍切片經(jīng)4種方法處理后，HE切片中產(chǎn)生的冰晶無法消除(圖1、2)，冰對組織HE切片仍可見冰晶。

實驗組新鮮組織冷凍切片后立即置于冷甲醇中固定(A和B法)，組織細(xì)胞均發(fā)生不同程度收縮，胞核深染，核質(zhì)比改變，間質(zhì)纖維收縮，特別是細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織改變較明顯。乳腺導(dǎo)管細(xì)胞收縮明顯、重疊。肺泡間隔縮小、結(jié)構(gòu)變形。腦組織細(xì)胞間產(chǎn)生空洞、胞核深染扭曲。細(xì)胞豐富、含水分較少及間質(zhì)緊致的組織則改變不明顯。卵巢及甲狀腺胞核收縮，部分腺泡上皮細(xì)胞緊密，腺泡及腺泡間結(jié)構(gòu)尚佳。肝細(xì)胞核稍收縮，血管周圍及間質(zhì)收縮。淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞胞核略收縮、染色質(zhì)清晰。

實驗組冷凍切片經(jīng)C法(自然晾干1、2、4、8和16 min)處理，晾干1、2 min冷凍切片細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)明顯，細(xì)胞形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生變形(圖3、4)；而晾干4、8、16 min冷凍切片細(xì)胞發(fā)生腫脹，核膜及染色質(zhì)淡染、模糊。實驗組冷凍切片經(jīng)D法處理與C法室溫晾干4 min結(jié)果相似。

①②③④

3 討論

冷凍切片制片質(zhì)量不佳是術(shù)中快速病理診斷發(fā)生延遲和誤診的重要原因，如切片厚、脫水透明不佳、冰晶等[2-4]。冷凍切片的制作是新鮮組織不經(jīng)脫水、透明等處理，快速冷凍到一定硬度后進(jìn)行切片染色的過程。每一步驟均可對冷凍切片質(zhì)量產(chǎn)生影響，包括標(biāo)本送檢、取材(≤3 mm)、冷凍的溫度和速度、固定液選擇和固定時間等[1]，其中冰晶現(xiàn)象是臨床及科研工作中備受關(guān)注的問題。

未固定的新鮮組織冷凍溫度下降緩慢，組織細(xì)胞的水分便會形成粗大冰晶，擠壓周圍的細(xì)胞或間質(zhì)成分，影響組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。筆者在實踐工作中也觀察到某些組織類型的冷凍切片迅速固定后出現(xiàn)類似冰晶現(xiàn)象，而在冰對組織石蠟切片中無此現(xiàn)象。馮家成等[5]報道腦組織冷凍切片立即置于固定液，切片呈網(wǎng)格狀，經(jīng)室溫放置2 min或電熱吹風(fēng)30 s后固定組織切片網(wǎng)格消失。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為及時固定是冷凍切片制作的第一要素，而作者觀察組織冷凍切片即刻固定后，均發(fā)生不同程度的細(xì)胞和間質(zhì)的收縮，特別在細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織中更易發(fā)生細(xì)胞緊密重疊、細(xì)胞核變形，疏松結(jié)締組織收縮牽拉導(dǎo)致腺體及導(dǎo)管的扭曲和腺腔消失等；而在細(xì)胞豐富、含水分較少及間質(zhì)緊致的組織中類冰晶現(xiàn)象較少見。《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊》中提到冷凍切片貼附于載玻片后需稍干才置于固定液中，但無確切的干燥時間可供參考。本實驗將冷凍切片分別于室溫干燥1、2、4、8和16 min置于冷甲醇中固定，發(fā)現(xiàn)室溫干燥1、2 min后，冷凍切片的類冰晶現(xiàn)象得到改善，組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)接近于石蠟切片，而冷凍切片經(jīng)4、8、16 min室溫干燥后細(xì)胞均腫脹、變性且耗時過長，無法滿足術(shù)中冷凍快速、準(zhǔn)確的要求。

術(shù)中快速病理診斷具有時限性(從取材到發(fā)出報告<30 min)，干燥時間過長會延緩報告發(fā)出，影響臨床醫(yī)師及時為患者提供下一步治療。因電熱風(fēng)干燥處理會導(dǎo)致細(xì)胞的收縮、形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，應(yīng)考慮用冷風(fēng)加速冷凍切片的干燥速度。然而在冷風(fēng)干燥20 s后，冷凍切片出現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)腫脹、胞核淡染、間質(zhì)增寬等變性表現(xiàn)。文獻(xiàn)報道[6]組織應(yīng)即刻固定，否則細(xì)胞不可避免的存在一定程度的破壞。本實驗嘗試將冷凍切片即刻固定于冷甲醇1 min后，再使用冷風(fēng)干燥20 s，發(fā)現(xiàn)其并不能改善類冰晶現(xiàn)象。

為了觀察冷凍切片中的真冰晶是否可通過室溫或者冷風(fēng)干燥的方式消除，本實驗將新鮮組織浸泡于生理鹽水15 min，使大量水分子進(jìn)入組織，人為地造成冷凍切片冰晶效果。其冷凍切片的大量冰晶經(jīng)室溫干燥1、2、4、8、16 min及冷風(fēng)干燥20 s后，仍可見大量空洞、間質(zhì)及細(xì)胞擠壓的現(xiàn)象，結(jié)果提示組織在發(fā)生冰晶后難以恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)。

新鮮組織經(jīng)過急速冷凍，如貼片后即刻放入固定液，組織中細(xì)胞及結(jié)締組織仍保持收縮狀態(tài)，特別是細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織收縮程度更明顯。通過熱脹冷縮的原理，本實驗發(fā)現(xiàn)冷凍切片在室溫干燥1、2 min時，收縮狀態(tài)的組織細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少或避免了細(xì)胞形態(tài)扭曲、胞核變形和組織結(jié)構(gòu)的變化，更好地體現(xiàn)組織細(xì)胞的生活狀態(tài)，有利于病理醫(yī)師發(fā)出準(zhǔn)確的術(shù)中快速病理診斷報告。