螺蟲乙酯及其代謝物和氯蟲苯甲酰胺在龍眼上的殘留動(dòng)態(tài)

劉艷萍, 王瀟楠, 常 虹, 顧燕萍, 孫海濱, 王思威

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

龍眼Dimocarpus longanLour. 是典型亞熱帶樹種，荔枝蒂蛀蟲是危害龍眼的主要害蟲之一，嚴(yán)重影響龍眼的產(chǎn)量和質(zhì)量。生產(chǎn)中對(duì)荔枝蒂蛀蟲主要采用氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素、螺蟲乙酯等藥劑進(jìn)行防治[1-2]。近年來(lái)中國(guó)雖加快了小作物農(nóng)藥登記及其最大殘留限量 (MRL) 標(biāo)準(zhǔn)制定工作，但目前在龍眼上登記的殺蟲劑僅有毒死蜱和氯氰菊酯[3]，登記農(nóng)藥不能滿足實(shí)際生產(chǎn)，生產(chǎn)中違規(guī)使用未登記農(nóng)藥的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

螺蟲乙酯 (spirotetramat，圖式1) 是新型季酮酸類殺蟲劑，農(nóng)藥殘留專家聯(lián)席會(huì)議 (JMPR) 定義其殘留物為螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物螺蟲乙酯-烯醇(B-enol)、螺蟲乙酯-單羥基 (B-mono)、螺蟲乙酯-酮-羥基 (B-keto) 和螺蟲乙酯-烯醇-糖苷 (B-glu) 之和，以螺蟲乙酯表示[4]。氯蟲苯甲酰胺 (chlorantraniliprole，圖式1) 是鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑，JMPR 定義其殘留物為氯蟲苯甲酰胺[5]。

目前中國(guó)[6]、國(guó)際食品法典委員會(huì) (CAC)[7]、歐盟[8]、日本[9]均尚未制定螺蟲乙酯在龍眼上的最大殘留限量 (MRL)值，美國(guó)規(guī)定螺蟲乙酯在龍眼上的MRL 值為13 mg/kg[10]。中國(guó)規(guī)定螺蟲乙酯在荔枝上的MRL 值為15 mg/kg[6]，CAC 規(guī)定為15 mg/kg[7]，歐盟為13 mg/kg[8]，美國(guó)為15 mg/kg[10]。中國(guó)、CAC、美國(guó)和日本尚未制定氯蟲苯甲酰胺在龍眼上的MRL 值，歐盟對(duì)皮不可食小型果中的氯蟲苯甲酰胺采用“一律限量”，限量值為0.01 mg/kg[8]。中國(guó)已制定氯蟲苯甲酰胺MRL 值的水果品種有：柑橘類 (0.5 mg/kg)、仁果類 (蘋果除外) (0.4 mg/kg)、蘋果 (2 mg/kg)、核果類 (1 mg/kg)、漿果 (1 mg/kg) 、其他小型水果 (0.4 mg/kg)、石榴 (0.3 mg/kg)及瓜果類水果 (黃瓜除外) (0.2 mg/kg)。

目前，雖然關(guān)于這兩種殺蟲劑殘留的研究報(bào)道較多[11-14]，但尚未見采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS) 檢測(cè)螺蟲乙酯和氯蟲苯甲酰胺在龍眼上的殘留量并進(jìn)行安全評(píng)價(jià)的報(bào)道。鑒于此，本研究擬采用HPLC-MS/MS，建立螺蟲乙酯及其代謝物和氯蟲苯甲酰胺在龍眼上殘留量的檢測(cè)方法，并以此方法測(cè)定22.4%螺蟲乙酯懸浮劑和5%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑在龍眼上施用后的最終殘留量，旨在為這兩種農(nóng)藥在龍眼上的科學(xué)合理使用以及制定其MRL 值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及主要儀器

99.0%螺蟲乙酯 (spirotetramat) 和99.7% Benol 標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (沈陽(yáng))；94.86% B-glu、94.03% B-keto、99.48% B-mono 和97.8%氯蟲苯甲酰胺 (chlorantraniliprole) 標(biāo)準(zhǔn)品，Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。

22.4%螺蟲乙酯懸浮劑 (SC)，拜耳股份公司；5%氯蟲苯甲酰胺SC，上海綠澤生物科技有限責(zé)任公司；甲醇和乙腈均為色譜純，氯化鈉和無(wú)水硫酸鈉等試劑均為分析純；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (質(zhì)譜為L(zhǎng)CMS-8045，液相為L(zhǎng)C-20AT)，日本島津公司；GTR22-1離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；OA-SYS氮吹儀，美國(guó)Organomation Associates 公司；XW-80A 渦旋儀，上海精科有限公司；ULTRATURRAXT 25 勻漿機(jī)，德國(guó)IKA 公司；Y-4 水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇金城國(guó)勝試驗(yàn)儀器廠；NEVAP24 氮吹儀，美國(guó)Organomation 儀器有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2018 年6 至9 月分別在廣東廣州和茂名、廣西、海南、福建以及云南6 地進(jìn)行。供試龍眼Dimocarpus longanLour. 品種分別為儲(chǔ)良、石硤、儲(chǔ)良、石硤、鳳梨穗和古山2 號(hào)。按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[16]，將22.4%螺蟲乙酯SC、5%氯蟲苯甲酰胺SC 按要求加水稀釋后，采用背負(fù)電動(dòng)式噴霧器均勻噴施于龍眼樹上，噴液量為900 L/hm2。

最終殘留試驗(yàn)：小區(qū)按順序排列，分別設(shè)處理區(qū)及空白對(duì)照區(qū)，每小區(qū)4 株龍眼樹，于幼果期開始噴霧施藥，施藥間隔期7～10 d。其中，22.4% 螺蟲乙酯SC 按有效成分60 mg/kg 施用2 次，采收間隔期為14、21 及28 d。5%氯蟲苯甲酰胺SC 按有效成分50 mg/kg 施用2 次，采收間隔期為7、14 及21 d。按間隔期采樣，每個(gè)處理小區(qū)至少采集2 個(gè)獨(dú)立樣品。按對(duì)照區(qū)、處理區(qū)的次序進(jìn)行采集，隨機(jī)采集不少于2 kg 生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的龍眼個(gè)體。全果樣品：取出果核并稱重，將果皮和果肉切碎、混勻，四分法縮分留樣100 g；果肉樣品：剝?nèi)ス?，取出果肉和果核，將果肉切碎、混勻，四分法縮分留樣100 g。所有樣品均于 ?20 ℃保存，待分析。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 稱取勻漿后的龍眼樣品 (全果或果肉) 10.0 g 于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈渦旋1 min，再加入5 g 氯化鈉劇烈振蕩渦旋1 min，于5 000 r/min 下離心2 min；取乙腈層2 mL；氮吹至近干后用V(甲醇) :V(水) = 60 :40 溶液定容至1 mL；加入0.1 g PSA，渦旋1 min，于10 000 r/min下離心2 min；取上清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)條件 氯蟲苯甲酰胺色譜條件：Shimpack GIST-HP C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相為V(0.1%甲酸水，含2 mmol/L乙酸銨) :V(乙腈)=25 : 75，運(yùn)行3 min；流速0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

螺蟲乙酯及代謝物色譜條件：Agilent Extend C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.1% 甲酸水(含2 mmol/L 乙酸銨)，B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，60% A+40% B；>1 min～7 min，20% A+80% B；>7 min～14 min，5% A+95% B；運(yùn)行14 min；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：正離子電離 (ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，離子源溫度300 ℃，毛細(xì)管電壓4 000 V。其他相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 螺蟲乙酯及其代謝物和氯蟲苯甲酰胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The mass spectrometry parameters of spirotetramat and its metabolites and chlorantraniliprole

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取10 mg (精確到0.1 mg) 螺蟲乙酯及代謝物B-glu、B-keto、B-enol 和B-mono，以及氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶中，配成質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別稀釋配制成10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別用空白龍眼全果和果肉樣品的提取液稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，配成質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.1、0.05 和0.01 mg/L 的螺蟲乙酯及其代謝物基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以及氯蟲苯甲酰胺基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.2 節(jié)條件測(cè)定，外標(biāo)法定量。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積 (y) 為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白龍眼樣品 (全果、果肉) 10.0 g，分別進(jìn)行0.01、0.1 和1.0 mg/kg 3 個(gè)水平的螺蟲乙酯及代謝物B-glu、B-keto、Benol 和B-mono 以及氯蟲苯甲酰胺在龍眼全果和果肉上的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)5 次。分別按1.3.1 節(jié)和1.3.2 節(jié)的方法及條件進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法準(zhǔn)確度、精密度及檢出限

添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明：螺蟲乙酯及其代謝物和氯蟲苯甲酰胺在龍眼全果和果肉中的平均回收率分別為83%～103%和87%～92%，RSD 分別為2.3%～8.7%和3.3%～6.3%，定量限均為0.01 mg/kg，符合殘留分析檢測(cè)要求[15]。典型色譜圖見圖1和圖2。

2.2 螺蟲乙酯和氯蟲苯甲酰胺在龍眼上的最終殘留量

結(jié)果 (表2) 表明：22.4% 螺蟲乙酯SC 按60 mg/kg 施用2 次，距末次施藥后14、21 和28 d，在龍眼全果中，螺蟲乙酯母體、B-enol、B-keto及B-glu 均有檢出，B-mono 低于0.01 mg/kg，果肉中螺蟲乙酯及代謝物均低于0.01 mg/kg。

表2 螺蟲乙酯及其代謝物在龍眼全果中的最終殘留量Table 2 The terminal residues of spirotetramat and its metablolites in whole longan

根據(jù)螺蟲乙酯殘留定義[4,17]，螺蟲乙酯總量 =螺蟲乙酯 + B-glu × 0.806 + B-keto × 1.177 + B-enol ×1.239 + B-mono × 1.231。

已有的研究結(jié)果表明，螺蟲乙酯在植物中的一級(jí)代謝產(chǎn)物為B-enol > B-keto，其中B-enol 能進(jìn)一步去甲基化、還原或氧化，得到產(chǎn)物B-keto、B-glu、B-mono 和B-desmsthyl-enol，螺蟲乙酯在不同作物中降解速率不同，而且不同作物中殘留代謝物種類及含量分布也有所不同[11-12]。

結(jié)果 (表3) 表明：5% 氯蟲苯甲酰胺SC 按50 mg/kg 施用2 次，距末次施藥后7、14 和21 d，氯蟲苯甲酰胺在龍眼全果中亦均有檢出，而在龍眼果肉中的殘留量均低于0.01 mg/kg。

表3 氯蟲苯甲酰胺在龍眼全果中的最終殘留量Table 3 The terminal residues of chlorantraniliprole in whole longan

龍眼果實(shí)由果皮、果肉 (假果皮)、種子構(gòu)成。依據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]和《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]的規(guī)定，以及JMPR制定的氯氰菊酯在龍眼上的殘留限量[18]，龍眼屬皮不可食小型果，檢測(cè)部位為去果核后的整個(gè)果實(shí)和果肉，但整個(gè)果實(shí)的殘留量計(jì)算包括果核。陳秀萍等[19]研究了中國(guó)福建、廣東、廣西、四川以及泰國(guó)、越南來(lái)源的龍眼，結(jié)果表明，種子占果實(shí)的質(zhì)量比為13.6%～19.4%。果核占全果的質(zhì)量比因品種和采收時(shí)間不同而不同，本研究針對(duì)每一批次的樣品測(cè)得果核占全果的質(zhì)量比為10%～20%，測(cè)定后一一對(duì)應(yīng)進(jìn)行折算，因此折算后的殘留量比實(shí)際測(cè)得的殘留量低。

3 結(jié)論與討論

本研究采用乙腈提取，PSA 吸附劑凈化，HPLC-MS/MS 檢測(cè)分析，建立了螺蟲乙酯及其代謝物和氯蟲苯甲酰胺在龍眼中殘留量的檢測(cè)方法，并依據(jù)此方法對(duì)22.4%螺蟲乙酯SC、5%氯蟲苯甲酰胺SC 在龍眼上的最終殘留樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，末次施藥后14 d，螺蟲乙酯和氯蟲苯甲酰胺在龍眼全果中的殘留量分別為0.30～1.14 和0.06～0.29 mg/kg，在果肉中的殘留量分別為 <0.05 和 <0.01 mg/kg。全果中的殘留量為果肉中的6～30 倍，表明螺蟲乙酯和氯蟲苯甲酰胺主要?dú)埓嬖诠ぶ小＿@可能是由于果皮為直接著藥部位，因此在龍眼干的加工過程中應(yīng)注意去除果皮上殘留的農(nóng)藥。

中國(guó)尚未制定這兩種農(nóng)藥在龍眼上的MRL值。特色小宗作物登記農(nóng)藥品種短缺與其病蟲害防控農(nóng)藥需求之間的矛盾，給各地農(nóng)業(yè)主管部門在農(nóng)藥經(jīng)營(yíng)和使用環(huán)節(jié)的監(jiān)督管理造成困難。由于缺少相關(guān)的藥效、殘留等試驗(yàn)，生產(chǎn)中違規(guī)使用容易造成藥害、殘留超標(biāo)等問題，直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。因此，加快推進(jìn)特色小宗作物用藥登記，解決特色小宗作物用藥短缺問題，有利于進(jìn)一步強(qiáng)化農(nóng)藥監(jiān)管，保障農(nóng)藥使用安全，保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。