抗O型口蹄疫兔化弱毒YNTBa株單克隆抗體的制備及其生物學特性鑒定

湯雅淇，李珂，艾軍，嚴紅亞，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201； 3.昆明海關技術中心，云南 昆明 650200)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV)引起豬、牛、羊等偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快、流行范圍廣，病毒可通過接觸易感動物和空氣傳播，易感動物接觸病毒后2～3d產生臨床癥狀，發病率為100%，幼畜經常不見癥狀而猝死，死亡率因病毒株而異，嚴重時可達100%。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口瘡病毒屬(Aphthovirus)成員，基因組為一長約8 500 bp的單股正鏈RNA分子[1]。FMDV目前已知有7個不同的血清型(A、O、C、Asia1和南非1、2、3型)，在每個血清型內存在多種亞型，不同血清型間無交叉免疫性。目前，O型FMDV存在10個不同拓撲型，即中東-南亞 (ME-SA)、東南亞 (SEA)、古典中國拓撲型(CATHAY)、歐洲-南美 (Euro-SA)、印度尼西亞-1(ISA-1)、印度尼西亞-2 (ISA-2)、東非-1 (EA-1)、東非-2 (EA-2)、東非-3 (EA-3)、西非拓撲型(WA)[2]。我國毗鄰的東南亞、南亞地區O型病毒變異頻繁，存在病原生物多樣性[3,4]，區域內FMD流行處于流行毒株多元化時期，不同血清型、不同遺傳譜系、不同進化階段的病毒混雜存在，各自循環，形成了復雜難解的防控局面[5-7]。

預防、控制和消滅FMD是我國獸醫研究的重大課題，其中研發口蹄疫的快速診斷、定型技術具有十分重要的臨床意義。單克隆抗體(monoclone antibody, mAb)能夠識別單一抗原位點，與抗原結合的特異性強。目前，國內諸多具有代表性的研究制備了多種抗口蹄疫病毒的單克隆抗體，用于FMDV診斷定型、抗體水平監測、疫苗免疫動物與自然感染的鑒別診斷、抗原表位分析等方面[8-14]。

為建立FMDV檢測方法，本研究用純化的O型兔化弱毒FMDV云南太保株(Yunnan Taibao attenuated strain, YNTBa)作為抗原，制備了1株O型FMDV的特異性mAb，分析了其生物學特性，為O型FMDV的診斷及其抗原位點研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑

HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、PEG(Mw，1500和6000)、HAT(50×)、HT(50×)選擇培養基均購自Sigma公司；IMDM高糖培養基和優質胎牛血清(FBS)為GIBCO公司產品；其他化學試劑均為分析純；免疫球蛋白標準亞類鑒定試劑盒購于RoChe公司。

1.1.2細胞、毒株及實驗動物

BHK-21細胞本實驗室凍存；SP2/0骨髓瘤細胞由昆明海關動物檢疫實驗室提供；BALB/c小鼠購于昆明醫科大學動物實驗中心；O型FMDV兔化弱毒云南太保株(YNTBa)適應于BHK-21細胞備用，由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1FMDV抗原制備

將YNTBa病毒(毒價為10-5.6TCID50/0.1 mL)按照MOI=0.01 TCID50劑量接種長滿單層的BHK-21細胞，于37℃、5% CO2培養16～18h后出現CPE，收集病變細胞，凍融2次，4℃、9000r/min離心1 h，收取上清用BEI滅活處理；滅活液按照比例加入80g/L PEG-6000和40g/L NaCl，4℃攪拌并放置12h; 次日4℃ 9000r/min 離心90min，回收沉淀，用NTE緩沖液重懸，然后4℃、29000r/min離心2h，棄上清；沉淀用NTE緩沖液浸泡，4℃過夜，次日重懸，充分混合均勻分裝，-70℃凍存備用。經PEG-6000沉淀純化病毒，測定蛋白含量，作為小鼠免疫抗原和ELISA包被抗原。

1.2.2間接ELISA檢測方法的建立

間接ELISA方法，采用方陣滴定法確定純化YNTBa抗原和抗體的最適工作濃度；用包被液按1∶50倍比稀釋抗原，包被酶標板；BALB/c小鼠陽性血清和陰性血清均做倍比稀釋，同時設立骨髓瘤細胞培養上清和空白對照；酶標二抗工作濃度1∶5000，TMB顯色后置于450 nm處讀取吸光值，P/N值最大的抗原稀釋度為最適濃度。

1.2.3動物免疫

取純化的YNTBa病毒抗原免疫BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原，按0.5mL/只(含抗原量50μg)皮下多點注射；間隔2周后，第2次免疫，用弗氏不完全佐劑乳化抗原，劑量途徑同上；間隔2周，第3次免疫，不加佐劑，劑量同上，腹腔注射。2周后尾部采血，分離血清，測定免疫小鼠血清抗體水平效價。取抗體效價最高的小鼠于融合前3d進行加強免疫，腹腔注射純化抗原，劑量100μg/只。

1.2.4細胞融合

加強免疫前1d，取正常BALB/c雌鼠腹腔細胞，按照常規方法制備飼養層細胞。加強免疫3d后，取血清效價最高的小鼠脾細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞按6∶1的比例混合，按照常規方法進行融合后，加入鋪有飼養細胞的96孔板，放置于含5% CO2培養箱37℃培養。第2天用HAT培養基進行半數換液，根據細胞狀態10d左右完全更換HT培養基進行培養。雜交瘤細胞孔適時進行轉移并擴大培養，采用間接ELISA和IFA方法檢測抗體，陽性孔適時進行亞克隆，直到獲得分泌穩定的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株[13]。

1.2.5單克隆抗體腹水的制備及純化

將0.5mL的滅菌液狀石蠟注射到10～12周齡小鼠腹腔，1周后，按1×106/只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，7～10d后，抽取腹部極度膨脹小鼠腹水， 37℃ 2～4h，隨后置4℃過夜，次日10000r/min 離心10min取上清，用ELISA方法檢測效價，再采用辛酸-飽和硫酸銨法進行提純，-70℃分裝保存。

1.2.6單克隆抗體效價的測定

用間接 ELISA 方法測定，細胞培養上清與腹水分別進行倍比稀釋，同時分別以 SP2/0 細胞培養上清和腹水做同等稀釋度作為對照。

1.2.7單克隆抗體亞類鑒定

按照抗體亞類鑒定試劑盒說明書，對所獲得的單克隆抗體進行抗體亞類鑒定。

1.2.8Western-blot分析

按照常規方法，將純化的YNTBa病毒進行SDS-PAGE電泳和轉印。轉印后用含5%脫脂乳的PBS 37℃封閉1h，用TBST充分洗滌后加入1∶1000倍稀釋的腹水單克隆抗體37℃搖床作用10min，4℃過夜，充分洗滌3次后加入1∶5000倍稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37℃作用40min，洗滌3次后用DAB顯色。

1.2.9單克隆抗體相對親和力測定

采用NaSCN洗脫法測定mAb的相對親和力，用間隔0.5mol/L連續濃度的NaSCN分別對腹水上清和SP2/0腹水上清與抗原形成的復合物進行洗脫，測定洗脫后抗體與抗原反應的OD450值。當OD450值下降到不經洗脫時的50%時，對應的NaSCN濃度即為抗體的相對親和力常數，以mol/L表示。

1.2.10單克隆抗體型特異性鑒定

采用IFA方法檢測，按本實驗室方法進行[15]。用O型的YNTBa病毒和A型FMDV毒株感染BHK-21細胞，同時設正常細胞對照，用冰冷無水乙醇固定10min，晾干后加入待檢測雜交瘤細胞上清。37℃作用40min，PBS洗滌后加入羊抗鼠FITC標記的IgG，37℃、40min，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.11單克隆抗體中和特性測定

按照常規病毒中和試驗進行，96孔微量板中加入50μL純化單克隆抗體，進行10倍連續倍比稀釋，每個稀釋度4孔；上述各孔中加入100 TCID50的YNTBa病毒50μL混合，37℃作用1h, 接種長滿單層BHK-21細胞的96孔板，37℃、5% CO2培養箱中培養觀察CPE。同時設立陽性、陰性血清對照、病毒對照和正常細胞對照。

2 結果

2.1 抗原制備及小鼠免疫

BHK-21細胞培養收獲YNTBa病毒，經差速離心、PEG-6000沉淀純化抗原，制備獲得病毒抗原。按照免疫程序，經3次免疫后的5只BALB/c小鼠間接ELISA測定血清效價。結果顯示：5只小鼠血清效價≥10-4稀釋度中，4號和5號小鼠較其他小鼠高，首選為試驗用鼠(圖1)。

圖1 小鼠血清10-4稀釋抗體效價

2.2 雜交瘤細胞株的建立

免疫小鼠脾細胞和SP2/0雜交瘤細胞按6∶1的比例混合融合，分散于10塊96孔板中培養；雜交瘤細胞培養上清經間接ELISA檢測，當雜交瘤細胞上清對YNTBa抗原與小鼠陰性血清、SP2/0細胞上清對YNTBa抗原OD值之比均大于2.1，判為陽性雜交瘤細胞。再經篩選及3次有限稀釋法克隆，結果獲得1株穩定分泌抗體的陽性雜交瘤細胞株，命名為9B3。

2.3 雜交瘤細胞培養上清及腹水抗體效價測定

采用間接ELISA法測定雜交瘤細胞培養上清和腹水抗體效價，將其分別進行倍比稀釋，測定OD450值；同時設立陽性、陰性血清對照。檢測樣品與陰性血清的OD450值(P/N)之比大于2.1時的mAb最大稀釋度確定為其ELISA效價。結果顯示：9B3雜交瘤細胞培養上清效價為1∶25 600，腹水效價為1∶106。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定

對獲得的9B3單克隆抗體進行亞型鑒定，結果顯示，此9B3單克隆抗體的重鏈類型為IgG2a, 輕鏈類型為κ(圖2)。

圖2 單抗亞型鑒定圖

2.5 Western-blot分析

用純化的YNTBa抗原進行SDS-PAGE電泳，在電轉印至PDVF膜上進行Western-blot分析。結果顯示：9B3單克隆抗體與O型FMDV YNTBa病毒無特異性條帶，表明該單抗所針對的抗原位點為空間構象表位。

2.6 單克隆抗體的相對親和力

分別用連續間隔0.5mol/L的不同濃度NaSCN對單抗9B3和SP2/0腹水進行洗脫，經測定9B3單克隆抗體的相對親和力指數為1.0mol/L(圖3)，表明9B3單抗具有中等強度的親和力。

圖 3 單抗9B3的相對親和力指數測定結果

2.7 單克隆抗體血清型特異性鑒定

將9B3單克隆抗體分別作用于感染O型FMDV YNTBa病毒和A 型FMDV的BHK-21細胞，進行IFA檢測。結果顯示：9B3對YNTBa可以產生特異性熒光，而與A型FMDV不產生熒光反應(圖4)。表明9B3單克隆抗體只針對O型FMDV起反應，具有病毒型特異性。

A：感染O型FMDV的BHK-21細胞與mAb 9B3的反應結果；B：感染A型FMDV的BHK-21細胞與mAb 9B3的反應結果。

2.8 單克隆抗體中和特性的檢測

運用微量病毒中和試驗鑒定9B3單克隆抗體的中和活性，對照陽性血清中和效價≥1∶32判為陽性，<1∶32判為陰性。結果顯示：O型FMDV陽性血清、空白、細胞和病毒對照均成立，此單克隆抗體中和性>1∶32，表明9B3不具備中和活性。

3 討論

試驗研究的目的是制備抗O型FMDV的特異性mAb，期望篩選出具有型特異性、識別譜廣、能夠用于開發檢測O型FMDV抗體的ELISA試劑盒。單抗制備免疫原O型FMDV兔化弱毒YNTBa病毒，來源于1958年云南保山地區流行的牛O型FMDV分離株，牛源強毒經適應3～5日齡乳兔后，連續傳代480代次以上，對牛源宿主毒力減弱，后再次適應BHK-21細胞[16]。YNTBa毒株全基因序列(GenBank No. KY072818)分析顯示該毒株屬于O型Cathay遺傳進化系譜較早的流行毒株[17]，與后期流行的O型Cathay系譜毒株的致病宿主與抗原差異明顯[2]。本文選擇制備該毒株單抗，還有用于分析該遺傳系譜毒株遺傳進化抗原識別位點變異加劇趨勢的研究。同時，該毒株具有良好的免疫原性，免疫小鼠能夠獲得高的抗體效價(圖1)，保證免疫小鼠與雜交瘤細胞融合，獲得陽性分離株。同時，在制備過程中發現，免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞合適的比例融合，也是成功獲得雜交瘤細胞的關鍵點。

試驗獲得1株抗O型FMDV的mAb 9B3，IFA試驗結果表明其具有型特異性(圖4)，推測其識別的抗原位點位于FMDV的衣殼蛋白上。但是病毒中和試驗表明該單抗不具有中和活性，而且根據Western-blot結果分析，9B3結合的位點屬于空間構想表位。FMDV mAb結合表位的保守性是其作為診斷試劑、選擇合適mAb的重要因素，下一步深入分析FMDV mAb 9B3識別的抗原位點，對于評估其作為廣譜抗原識別位點、研發檢測ELISA試劑具有科學意義。此外，本文尚不能確定該單抗識別不同O型FMDV遺傳系譜毒株的能力，特別是近年主要流行的SEA、ME-SA(含泛亞-1和泛亞-2)拓撲型的識別能力，有必要針對不同流行毒株制備不同批次單克隆抗體，研究其識別的不同免疫優勢位點，增加基于單抗建立血清學檢測方法的靈敏度。

試驗制備獲得1株針對O型FMDV的單克隆抗體雜交瘤細胞株9B3；該單抗屬于IgG2a/κ亞類，具有FMDV血清型特異性、不具有病毒中和活性，識別非線性的抗原表位。該單抗為O型FMDV抗原表位研究及檢測方法的建立奠定了基礎。