乙醇干擾線蟲味覺可塑性相關基因的生物信息學分析*

曹亞偉 李 晉

（周口師范學院生命科學與農學學院 河南周口 466001）

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）屬線形動物門、線蟲綱。有研究表明，在揮發性的化學引誘劑（例如,乙醇）的作用下，線蟲會表現出適應性與食物信號關聯的可塑性行為，即味覺可塑性［1］。

乙醇作用于學習和記憶的分子機制目前仍不甚了解。有研究指出，Tph-1基因、Ser-4基因、Ser-7基因通過復合胺信號參與乙醇對線蟲味覺可塑性的調控［2］。復合胺信號是一種吲哚衍生物，與人的情緒調節、細胞發育有關。色氨酸羥化酶（TPH）在額葉皮質、杏仁核、海馬區等腦區的表達豐富,是復合胺信號的限速酶之一,決定了活體復合胺信號的濃度。既往遺傳學研究認為，Tph-1基因能部分導致復合胺信號水平降低及降低抑郁癥的發生［3］。也有研究發現，復合胺信號參與調控腦回路的結構及可塑性作用［4］。TPH 是褪黑激素生物合成的第1 個酶，在脊椎動物松果體中表達［5］。Tph-1基因的突變會導致聯想學習的缺陷，外源性的復合胺可在一定程度上恢復學習和感覺的缺陷。而且，過量表達的Tph-1可提高線蟲的學習及感覺能力［6］。Ser-4基因和Ser-7基因編碼G 蛋白偶聯受體［7-8］。Ser-4基因在復合胺信號對壽命及產卵行為有重要調控作用［9］。Ser-7基因在復合胺信號中調控組織缺氧增強的感知行為及咽部泵動［10］。目前,對線蟲Tph-1、Ser-4、Ser-7基因的研究不多，至今仍未有對上述基因的生物信息學方面研究的報道。

運用生物信息學的方法，對上述基因進行分析，以期為揭示乙醇干預動物神經行為可塑性的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 線蟲復合胺信號關鍵基因生物信息學分析數據來源 NCBI 數據庫獲取線蟲的Tph-1（NC_003280.10）、Ser-4（NC_003281.10）、Ser-7（NC_003284.9）的核酸及氨基酸序列。

1.2 線蟲復合胺信號關鍵基因生物信息學分析工具

使用ExPASy -PortPara （http://web.expasy.org/protparam/）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白質理化性質。

使用ProtScale 軟件（http://web.expasy.org/protscale/）對Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白進行親疏水性預測。

使用SignalP-5.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/）預測Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白信號肽。

使用HMMTOP （http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜結構。

使用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7蛋白亞細胞定位。

使用NeTphos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/Services/NeTphos-3.1/）分析預測Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白磷酸化修飾位點。

2 線蟲復合胺信號關鍵基因生物信息學分析

2.1 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白基本理化性質分析

Tph-1 蛋白含有429 個氨基酸，分子質量為49 117.58，等電點為5.76，分子式為C2192H3374-N596O654S18，包括6 834 個原子。正電荷數（Arg+Lys）為49 個，負電荷數（Asp+Glu）為61 個。Tph-1 蛋白半衰期為30 h，不穩定系數為40.47，為不穩定蛋白；脂肪族系數為78.04；總平均親水性為-0.418，即Tph-1 蛋白為帶負電荷的不穩定親水性蛋白質（圖1A）。2 個軟件預測一致。

Ser-4 蛋白含有445 個氨基酸，分子質量為50 141.84，等電點為9.41，分子式為C2275H3633-N609O622S21，包括7 160 個原子。正電荷數（Arg+Lys）為53 個，負電荷數（Asp+Glu）為37 個。Ser-4 蛋白半衰期為30 h，不穩定系數為40.93，為不穩定蛋白；脂肪族系數為104.29；總平均親水性為0.154，即Ser-4 蛋白為帶正電荷的不穩定疏水性蛋白質（圖1B）。2 個軟件預測一致。

Ser-7 蛋白含有410 個氨基酸，分子質量為46 093.54，等電點為9.46，分子式為C2107H3345-N543O563S25，包括6 583 個原子。正電荷數（Arg+Lys）為45 個，負電荷數（Asp+Glu）為27 個。Ser-7 蛋白半衰期為30 h，不穩定系數為36.39，為穩定蛋白；脂肪族系數為107.32；總平均親水性為0.358，即Ser-7 蛋白為帶正電荷的穩定疏水性蛋白質（圖1C）。2 個軟件預測一致。

圖1 蛋白質親、疏水性分析

2.2 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白信號肽分析

對Tph-1 蛋白、Ser-4 蛋白、Ser-7 蛋白進行信號肽分析，結果表明，3 種蛋白質均無明顯信號肽序列。Tph-1 蛋白（圖2A）信號肽可能性為0.0006，Ser-4 蛋白（圖2B）信號肽可能性為0.0008，Ser-7蛋白（圖2C）信號肽可能性為0.004。

圖2 蛋白質信號肽分析

2.3 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜區分析

HMMTOP 預測Tph-1 蛋白（圖3A）沒有跨膜結構。Ser-4 蛋白（圖3B）有7 個跨膜區，跨膜螺旋為 ：107 -131aa、144 -168aa、183 -202aa、223 -242aa、269-288aa、424-443aa、460-479aa。Ser-7蛋白（圖3C）有7 個跨膜螺旋，跨膜螺旋為：97-121aa、132 -154aa、167 -191aa、212 -234aa、261 -278aa、375-395aa、408-426aa。

圖3 HMMTOP 預測蛋白跨膜區分析

2.4 Tph -1、Ser -4、Ser -7蛋白亞細胞定位Cell-PLoc 2.0 預測結果為：Tph-1 蛋白在細胞質表達，Ser-4 蛋白和Ser-7 蛋白在細胞膜表達。

2.5 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白磷酸化修飾位點預測 對3 種蛋白質進行磷酸化修飾位點預測（表1、圖4），磷酸化修飾位點最多的是絲氨酸，最少的是酪氨酸。Ser-4 蛋白磷酸化修飾位點最多，為71個；Ser-7 蛋白磷酸化修飾位點最少，為60 個。絲氨酸磷酸化修飾位點與磷酸化修飾位點總數均為差異非常顯著，蘇氨酸磷酸化修飾位點為差異顯著，酪氨酸差異不顯著。

表1 3 種蛋白磷酸化修飾位點預測

3 討論

研究發現，長期攝入乙醇，導致機體產生乙醇依賴甚至成癮。其原因為乙醇通過調控神經遞質、電壓通道及激素受體等靶細胞，影響基因轉錄、表達和細胞代謝，導致機體對乙醇耐受［11］。有研究發現，酗酒會引起基因改變，影響調控生物鐘的period2基因及調節應激系統POMC基因表達降低，導致對乙醇更強的渴望［12］。而且，包括抑郁癥、暴食癥、強迫癥及酒精中毒在內的行為障礙均與復合胺信號的缺陷有關［13］，即人類的行為障礙疾病可能與Tph-1、Ser-4、Ser-7基因有關。

本文生物信息學結果顯示，Tph-1 蛋白含有429 個氨基酸，等電點為5.76，半衰期為30 h，為不穩定且親水性蛋白質。Ser-4 蛋白含有445 個氨基酸，等電點為9.41，半衰期為30 h，為不穩定且疏水性蛋白質。Ser-7 蛋白含有410 個氨基酸，等電點為9.46，半衰期為30 h，為穩定且疏水性蛋白質。

Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜區分析結果與山羊、京海黃雞［14-15］等物種的G 蛋白結構相似，均為7 次跨膜結構。蛋白質磷酸化分析結果表明，Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白都是功能活躍的跨膜蛋白。因為3 種蛋白沒有信號肽，可知不是分泌蛋白。而是由游離核糖體合成，轉移到細胞質或細胞膜表達。

本研究結果有利于Tph-1、Ser-4、Ser-7基因的后續研究分析，為以后研究乙醇調控線蟲味覺可塑性的分子機理提供理論依據。

4 結論

結果表示，Tph-1 蛋白含有429 個氨基酸，等電點為5.76，為不穩定且親水性蛋白質，沒有明顯的信號肽序列及跨膜螺旋，且在細胞質表達，有62 個磷酸化修飾位點。Ser-4 蛋白含有445 個氨基酸，等電點為9.41，為不穩定且疏水性蛋白質，無明顯的信號肽序列，含有7 個跨膜螺旋，且在細胞膜表達，有71 個磷酸化修飾位點。Ser-7 蛋白含有410 個氨基酸，等電點為9.46，為穩定且疏水性蛋白質，無明顯的信號肽序列，含有7 個跨膜螺旋，且在細胞膜表達，有60 個磷酸化修飾位點。