UPLC-MS/MS測定水和土壤中唑啉草酯及其代謝物的方法驗證

楊志富，歐曉明，曾利紅，湯 濤，梁 驥，侯根連，歐 將

（1.湖南化工研究院有限公司國家農藥創制工程技術研究中心，長沙 410014；2.農用化學品湖南省重點實驗室，長沙 410014；3.湖南化研院檢測技術有限公司，長沙 410014；4.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，杭州310021）

唑啉草酯屬于先正達開發的一種新苯基吡唑啉類除草劑，作用機理為通過抑制乙酰輔酶A羧化酶，造成植物脂肪酸生物合成受阻，使細胞生長分裂停止，破壞細胞膜含脂結構，導致雜草死亡。我國已于2010年登記用于防除冬小麥和春小麥以及大麥田一年生禾本科雜草[1-3]。唑啉草酯應用于田間后，主要的代謝產物有M2和M3，母體和代謝物均可能隨雨水、淋溶等進入自然水體和土壤中，影響生物生長從而造成生態風險[4-5]。建立唑啉草酯及其代謝物M2、M3在水和土壤中的分析檢測方法，旨在為該藥劑在環境中的研究及風險評估提供技術支持。

目前關于唑啉草酯的報道多為合成[6-7]、應用技術[8-10]、質量控制[11]和在植物基質中的殘留分析[12]，未見同時對其母體和代謝物在水和土壤中的檢測方法。農藥在環境介質中的殘留量一般較低，普通的液相色譜分析方法的檢出限難滿足分析要求。筆者建立的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法具有更高的靈敏度，經驗證可用于唑啉草酯及其代謝物M2、M3的環境歸趨和環境毒理試驗中農藥殘留分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

唑啉草酯標準品（純度98.4%），國家農藥質量監督檢驗中心（沈陽）；唑啉草酯代謝物M2標準品（純度99.8%），北京科潤天朗環境技術有限公司；唑啉草酯代謝物M3標準品（純度99.3%），北京科潤天朗環境技術有限公司。

1.2 儀器設備

Agilent 1290/G6470型三重四極桿液質聯用儀、Agilent Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.8μm），美國安捷倫公司；LC-30A/LCMS-8050型超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，日本島津公司；SPS 402F型電子天平（0.01 g），梅特勒·托利多（常州）測量技術有限公司；AL204型電子天平（0.000 1 g），梅特勒·托利多國際貿易（上海）有限公司；Hei-vap型旋轉蒸發儀，德國海道爾夫德祥科技有限公司；ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.7μm），美國沃特世科技有限公司。

供試水和土壤按相關要求采集、處理[13]，主要參數信息見表1。

表1 供試水和土壤主要參數信息表

1.3 分析檢測方法

1.3.1 儀器方法

色譜條件：流動相A（0.1%甲酸水溶液）；流動相B（0.1%甲酸甲醇溶液）；柱溫為40℃；進樣體積為5 μL。梯度洗脫程序見表2[12,14]。

表2 液相梯度洗脫程序

質譜條件：離子源為ESI＋；檢測方式為多反應監測；interface電壓為4.0 kV；霧化器流速為3.0 L/min；干燥氣流速為10.0 L/min；加熱氣流速為10.0 L/min；interface溫度為300℃；DL溫度為250℃；Heat Block溫度為400℃。質譜信息見表3。

表3 農藥質譜檢測離子對信息

1.3.2 前處理方法

量取50 mL水樣于250 mL分液漏斗中，加入10 g氯化鈉，搖勻溶解，加入80 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1，V/V，含1%0.1 mol/L鹽酸），劇烈萃取3 min，上層清液過無水硫酸鈉后收集于250 mL錐形瓶中，再用80、50 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1，V/V）萃取2遍，合并上層清液并在50℃下旋蒸至近干。用5 mL乙腈-水（1∶1，V/V）定容，過膜，待LC-MS/MS檢測。

稱取5 g（精確至0.01 g）土壤樣品于250 mL塑料離心管中，加入50 mL乙酸乙酯-乙腈（1∶1，V/V），再加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸，搖勻后超聲5 min，離心，過無水硫酸鈉后收集于250 mL圓底燒瓶中，再用50 mL乙酸乙酯-乙腈（1∶1，V/V）振蕩提取2遍，每次30 min，隨后離心，合并上清液至圓底燒瓶中，于50℃水浴中旋轉蒸發至近干，冷卻后用5 mL乙腈-水（1∶1，V/V）定容，過0.22μm有機相濾膜至進樣瓶中，待LC-MS/MS檢測。

2）幾何模型建立范圍為：上下游方向，以山梁山脊線為基線分別向河流上、下游方向；垂直河流方向，從河谷向山。建立有限元計算模型。

1.3.3 對照品溶液配制

分別配制唑啉草酯、唑啉草酯代謝物M2、唑啉草酯代謝物M3標準儲備液（母液），然后配制1.0 mg/L的唑啉草酯、M2和M3的混合標準工作液（用色譜純乙腈定容，2～8℃保存，有效期為1個月）。將該工作液用樣品基質提取液逐級稀釋，得到0.25、1.0、5.0、20、50、100μg/L的基質系列標準工作液（現配現用）。

1.4 方法驗證

1.4.1 儀器方法

質譜條件：AJS-ESI＋為正離子掃描；離子噴霧電壓為3.5 kV；霧化器壓力為310.3 kPa；干燥氣溫度為5 L/min；干燥氣流速5 L/min；鞘氣流速為11 L/min；其他質譜條件與1.3.1中相似。

1.4.2 前處理方法

與1.3.2前處理方法相同。

1.4.3 線性與范圍

將1.0 mg/L的唑啉草酯、M2和M3的混合標準工作液分別用乙腈-水（1∶1，V/V）和樣品基質提取液逐級稀釋配制成0.25、1.0、5.0、20、50、100μg/L質量濃度的溶劑系列標準溶液和基質系列標準溶液，制作標準曲線。

1.4.4 添加回收試驗

在供試自來水和紅壤土中進行加標回收試驗，自來水添加濃度分別為0.1、1和1 000μg/L，紅壤土中添加濃度分別為1、10和1 000μg/kg，每個濃度重復6次，同時設不加藥的空白對照，按上述儀器條件和樣品前處理方法進行分析檢測。

2 結果與分析

2.1 線性試驗結果和最小檢出限

當基質效應小于20%，可使用溶劑標準曲線進行計算，否則需用基質標準曲線進行計算[15]。唑啉草酯、M2、M3的基質效應在自來水中為3.17%～20.10%，紅壤土中為19.8%～53.0%。驗證結果存在基質效應，需選擇基質標標準曲線計算。取信噪比為3倍對應的待測物質量濃度作為檢出限。自來水、紅壤土中唑啉草酯的線性結果見表4，相關系數均大于0.990。結果表明，該方法線性關系較好、檢出限低、靈敏度高。

表4 不同基質中3種分析物的線性相關性、檢出限和定量限（n=6）

2.2 準確度、精密度試驗結果

加標回收率試驗結果，見表5。在自來水和紅壤土中分別添加3個水平（低、中、高）3種物質的標準混合溶液，平行測定6次，以基質標為基準計算回收率。唑啉草酯、M2、M3在自來水中添加量為0.1、1.0、1 000μg/L時，平均回收率分別為86%～98%、81%～94%、96%～105%，相對標準偏差均小于9%；在紅壤土中添加量為1.0、10、1 000μg/kg時，平均回收率分別為87%～100%、91%～104%、86%～104%，相對標準偏差在均小于7%，表明該方法回收率高，準確度好。

表5 自來水和紅壤土中唑啉草酯、M2、M3的準確度和精密度結果（n=6）

2.3 再現性試驗結果

根據相同方法進行回收率試驗，自來水和紅壤土中分別做了低、中、高3檔添加濃度，每個濃度6次重復。結果顯示，在自來水中的唑啉草酯日內和日間精密度分別為2%～10%和7%～11%；M2的日內和日間精密度分別為2%～6%和3%～4%；M3的日內和日度精密度分別為3%～8%和6%～10%。在紅壤土中唑啉草酯的日內和日間精密度分別為3%～11%和4%～6%；M2的日內和日度精密度分別為2%～8%和1%～6%；M3的日內和日度精密度分別為2%～12%和6%～9%，均小于15%，表明該方法重復性好，精密度高。

2.4 選擇和專屬性試驗結果

空白基質樣品、最低檔濃度標樣、低檔添加濃度質譜進樣。結果表明，加標樣品圖譜中除3種標準物質峰外，未見其他雜峰產生有效干擾（圖1、2），表明方法的選擇性高、專屬性好。

圖1 自來水中唑啉草酯M2、M3子離子質譜圖

2.5 耐用性試驗結果

方法驗證時對比了不同的儀器品牌、色譜柱型號、柱溫等條件。結果顯示，唑啉草酯、M2、M3含量的相對標準偏差小于1.0%，說明該方法的耐用性較好。

圖2 紅壤土中唑啉草酯M2、M3子離子質譜圖

3 結 論

參照NY/T 3151—2017《農藥登記土壤和水中化學農藥分析方法建立和驗證指南》[15]，筆者采用超高效液相色譜-串聯質譜法建立了自來水和紅壤土中唑啉草酯、M2、M3殘留量的分析方法，并對其進行了驗證。該方法的靈敏度、準確度和精密度、耐用性等均符合要求，方法簡單、快速、準確，一次進樣能檢測唑啉草酯及其代謝物的殘留量，滿足環境試驗中痕量樣品低濃度的檢測要求。