白藜蘆醇對急性肺損傷大鼠的抗炎作用研究

朱詩乒　樓雅芳　黃小芳　丁旭春　胡晶晶　鄧浩然　蔡宛如

[摘要] [關鍵詞] 急性肺損傷;大鼠;白藜蘆醇;腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R331? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）27-0034-03

The anti-inflammatory effects study of resveratrol on acute lung injury rats

ZHU Shiping1? ?LOU Yafang1? ?HUANG Xiaofang1? ?DING Xuchun1? ?HU Jingjing1? ?DENG Haoran1? ?CAI Wanru2

1.Department of Respiratory Medicine，Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou?; ?310007，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou? ?310005，China

[Abstract] Objective To evaluate the protective efficacy of resveratrol，an effective component of polygonum cuspidatum，on acute lung injury through animal experiments. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into the blank group（n=10），the model group （n=10），the solvent control group （n=10） and the resveratrol treatment group （n=10）. The acute lung injury model was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide （LPS）. The solvent group was intraperitoneally injected with monomer dissolvent agent （fat emulsion），while the resveratrol treatment group was intraperitoneally injected with resveratrol and solubilizer. They were injected intraperitoneally 24 hours before，during and within 24 hours after the model was established. Samples were collected 48 hours after the model was established. Meanwhile，the lung tissues were examined by pathological staining，and the neutrophil ratio，tumor necrosis factor-α （TNF-α） and lactate dehydrogenase （LDH） contents in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected. Results The neutrophil ratio and TNF-α in BALF of resveratrol treatment group were （68.432±20.623），（92.644±11.322）ng/L，which were higher than those of （87.023±4.032），（106.654±4.606）ng/L in the solvent control group，with statistically significant differences （P<0.05）. There was no statistically significant difference in LDH values between the two groups of BALF（P>0.05）.? Conclusion Resveratrol treatment group can significantly reduce pulmonary interstitial inflammatory cell infiltration，pulmonary interstitial edema，bronchoalveolar wall thickening and bronchoalveolar cavity destruction degree. Resveratrol has certain anti-inflammatory efficacy on rats with acute lung injury.

[Key words] Acute lung injury; Rats; Resveratrol; Tumor necrosis factor-α

肺部炎癥進展導致氧氣交換功能障礙并引起嚴重低氧血癥是急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）重要特征，其作為呼吸系統(tǒng)危急重癥疾病，臨床預后差，病死率居高不下[1]，防治本類疾病具有非常重要的臨床意義。ALI的具體疾病機制尚未闡明，迄今為止缺乏有效的治療藥物和手段。天然藥物存在一定的治療前景，基于前期研究，已證明中藥“虎杖”其復方中藥制劑可抑制急性肺損傷大鼠肺部炎癥反應，顯示出一定的抗炎治療作用[2-3]。但是，其具體單體及機制尚未闡明。白藜蘆醇是虎杖的重要活性成分，也是其主要成分。在國外的相關試驗證實白藜蘆醇具有較強的抗炎活性，但是，其在急性肺損傷中的研究還不多見。因此，本研究通過SD大鼠的急性肺損傷模型評價白藜蘆醇對肺炎炎癥的保護作用，為進一步探討其相關作用機制提供基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

40只清潔級健康雄性SD大鼠（由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證號：2011A033），體重為（200±20）g。本實驗經(jīng)過動物倫理委員會審批通過。

1.2試劑和藥物

白藜蘆醇（98%分析純）;LPS;液態(tài)異氟烷;脂肪乳（250 mL∶50 g大豆油，3 g卵磷脂）;LDH測定試劑盒;TNF-α ELISA測定試劑盒;生理鹽水等。

1.3 實驗儀器

冰箱;孵育箱;大鼠灌胃器;電子天平稱;燒杯;離心機;酶標儀;液態(tài)霧化吸入裝置;移液槍;光學顯微鏡;自動包埋機;切片機;玻片等。

1.4模型建立

隨機將40只SD大鼠分為4組，每組各10只，分別為空白對照組、肺損傷模型組、溶劑對照組和白藜蘆醇治療組。將肺損傷模型組、溶劑對照組和白藜蘆醇治療組大鼠進行急性肺損傷造模。方法如下：液態(tài)霧化裝置霧化異氟烷并讓大鼠吸入麻醉，除毛消毒后進行氣管分離及切開;LPS溶液（配置1 mg/mL濃度）通過1 mL針筒緩慢注射入大鼠氣管中（1.5 mg/kg劑量），將切口縫合消毒后并將大鼠輕輕擺動，使其能夠在大鼠肺組織中均勻分布。空白對照組小鼠不進行造模。

1.5給藥方法

將白藜蘆醇溶解于脂肪乳劑中（配置1 mg/mL濃度），除了空白對照組外，其余各組大鼠均在造模前24 h、造模時以及造模后24 h 3個時間點進行腹腔內(nèi)給藥（劑量10 mg/kg）。

1.6 標本收集

在造模完成48 h后，麻醉大鼠并將大鼠進行解剖，暴露肺部收集標本：①肺部組織：取左上肺葉分剪成三段，進行HE染色;②肺泡灌洗液：結扎左上支氣管，用生理鹽水在右側及左下肺行肺泡灌洗，將灌洗液搖勻并放入離心管中，低速離心后取上層清液，可保存于-80℃冰箱中。

1.7實驗指標

1.7.1 病理檢查? 大鼠肺組織需要進行HE染色，顯微鏡觀察其肺部組織病理改變。

1.7.2 BALF中性粒細胞比值、TNF-α及LDH? 將肺泡灌洗洗液離心，用移液槍吸出細胞沉渣約1 mL并鋪展于玻片上，風干后對細胞進行瑞氏染色，計算出中性粒細胞比值。采用酶聯(lián)免疫法檢測肺泡灌洗液中TNF-α含量;檢測肺泡灌洗液中LDH含量。

1.8統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鏡下觀察HE染色

①空白對照組：肺泡結構完整，肺間質(zhì)無炎癥細胞浸潤，肺泡壁無明顯水腫及充血。②肺損傷模型組：肺泡腔結構出現(xiàn)破壞，肺泡相互融合，肺泡間隔增寬明顯，肺間質(zhì)見大量的炎癥細胞（中性粒細胞、淋巴細胞等）浸潤及出血，肺泡腔內(nèi)可見少量炎癥細胞（中性粒細胞、淋巴細胞等）浸潤及出血，充血水腫明顯。③溶劑對照組：與肺損傷模型組相比病理改變大致相同。④白藜蘆醇治療組：肺泡結構的破壞、肺泡壁炎癥增厚及充血水腫、肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞的浸潤及出血均較溶劑對照組有所減輕。見封三圖6。

2.2各組大鼠BALF中性粒細胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量比較

空白對照組BALF中性粒細胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量最低，與肺損傷模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002、0.002、0.001<0.01）;溶劑對照組中性粒細胞數(shù)百分比、TNF-α及LDH含量較肺損傷模型組無明顯差異（P=0.679、0.569、0.382>0.05），提示溶劑對ALI無治療作用。白藜蘆醇治療組中性粒細胞數(shù)百分比、TNF-α與溶劑對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003、0.007<0.01）。白藜蘆醇治療組LDH與溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.256>0.05）。見表1。

3 討論

在ALI發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應始終是重要的啟動及發(fā)展因素，且需要各種炎癥調(diào)控通路（如NF-κB通路等）的參與調(diào)控[4]。其中細菌感染引起的急性肺損傷在臨床上最為多見[5]，LPS可以刺激氣道上皮細胞、中性粒細胞及肺泡巨噬細胞[6]，使其過量產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子[7]，進而引起并發(fā)展成炎癥因子瀑布，甚至引起死亡。其中，中性粒細胞是由LPS介導的急性炎癥反應過程中最為重要的炎癥細胞，是ALI發(fā)生炎癥反應時最先被募集的細胞，其通過釋放蛋白酶加重炎癥反應，還可遷移到肺部進行脫顆粒進一步釋放炎癥介質(zhì)（殺菌蛋白、細胞因子和活性氧）引起促炎反應。因此，其在肺泡中的含量能夠反映肺組織的炎癥程度[8]。當肺部炎癥進一步加重時，活化的肺泡巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1β，使肺泡中其他細胞（如肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞等）產(chǎn)生趨化因子，激活炎癥級聯(lián)反應，導致炎癥細胞不斷遷移至肺部，擴大的炎癥反應進一步損傷相關組織細胞，從而導致肺組織的進一步損害[9]。在促炎因子中，以TNF-α最為顯著，是炎癥反應中具有始動和關鍵性作用的促炎因子，其能聚集并激活中性粒細胞，引起肺泡細胞的溶解，促使更多炎癥細胞在肺內(nèi)募集遷移及血管內(nèi)皮損傷，進而導致炎癥因子爆發(fā)式釋放從而加劇肺損傷。因此，其是急性肺損傷炎癥反應過程中最為重要的標志物之一[10]。

另外，在LPS導致的ALI中，肺臟內(nèi)聚集了大量中性粒細胞與巨噬細胞能夠產(chǎn)生并釋放大量氧自由基（Oxygen free radical，OFR），引起肺組織內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)失去平衡[11]。大量的活性氧促發(fā)脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜結構，引起血及肺組織中LDH含量增加[12]。因此肺組織中LDH含量可反映肺部炎癥損傷時其氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡程度。

通過前期的基礎實驗研究發(fā)現(xiàn)，虎杖及其中藥復方可以減輕動物模型的急性肺損傷引起的肺部炎癥反應，具有一定的抗炎作用，但其具體中藥活性單體及具體作用機制尚不十分明確[13]。國外的相關研究證明，白藜蘆醇具有較強的抗氧化活性，能夠清除自由基并對花生四烯酸代謝產(chǎn)生影響，從而使DNA免受損傷[14-15]，其是一種抑炎因子，相關研究證實其可直接抑制炎癥反應[16]。國內(nèi)有學者證實，其能抑制NF-κB信號轉導通路而達到抗炎作用[17-18]，但其對于急性肺損傷的抗炎研究鮮見報道[19-20]。

本研究結果證實，白藜蘆醇對急性肺損傷大鼠肺部的抗炎保護作用，在組織病理學上，白藜蘆醇治療組大鼠的肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤、充血水腫、呼吸膜增厚、肺泡腔結構破壞程度等一系列病理改變得到改善。在細胞層面能夠降低大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞比值，在炎癥因子層面，其能有效降低肺泡灌洗液中的TNF-α。以上數(shù)據(jù)均提示白藜蘆醇在急性肺損傷大鼠中顯示出一定抗炎保護作用。值得注意的是，本研究結果顯示，白藜蘆醇治療組較溶劑對照組的肺泡灌洗液中的乳酸脫氫酶（LDH）雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示在急性肺損傷中，白藜蘆醇對大鼠肺組織保護很可能與抗炎作用相關，而與其抗氧化作用是否有直接關系需要通過進一步大樣本量實驗研究證實。

綜上所述，白藜蘆醇對急性肺損傷具有抗炎保護作用，其具體機制可能與降低肺組織中TNF-α等重要的促炎因子相關，具體炎癥通路需要進一步實驗證實。

[參考文獻]

[1] Butt Y，Kurdowska A，Allen TC. Acute lung injury：A clinical and molecular review[J].Arch Pathol Lab Med，2016， 140（4）：345-350.

[2] 洪輝華，蔡宛如. 芪冬活血飲對急性肺損傷模型大鼠caveolin-1和細胞因子的影響[J].浙江中西醫(yī)結合雜志，2015，25（5）：432-435.

[3] 洪輝華，楊珺超，高潤娣，等.芪冬活血飲對急性肺損傷大鼠TLR4/NF-κB炎癥信號通路的影響[J].溫州醫(yī)科大學學報，2015，45（5）：332-337.

[4] 許志恒，李宏貴，黃展明.膿毒癥大鼠血清降鈣素原、內(nèi)毒素與其肺損傷的關系研究[J].新中醫(yī)，2018，50（9）：6-8.

[5] 卜克，王璐，劉林剛.保護素DX對膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2018，28（9）：28-32.

[6] Davino-Chiovatto JE，Oliveira-Junior MC，MacKenzie BMontelukast，et al. Leukotriene inhibitor，reduces lps-induced acute lung inflammation and human neutrophil activation[J].Arch Bronconeumol，2015，36（2）：179-187.

[7] Wang Y，Wang X，Zhang L，et al. Alleviation of acute lung injury in rats with sepsis by resveratrol via the phosphatidylinositol 3-kinase/nuclear factor-erythroid 2 related factor 2/heme oxygenase-1（PI3K/Nrf2/HO-1） pathway[J]. Med Sci Monit，2018，24（5）：3604-3611.

[8] Aulakh GK. Neutrophils in the lung：" the first responders"[J].Cell Tissue Res，2018，371（3）：577-588.

[9] Matthay MA，Zemans RL，Zimmerman GA，et al.Acute respiratory distress syndrome[J].Nat Rev Dis Primers，2019， 5（1）：18.

[10] Scott BNS，Kubes P.Death to the neutrophil：A resolution for acute respiratory distress syndrome？[J].Eur Respir J，2018，52（2）：1 801 274.

[11] Chang HY，Chen YC，Lin JG，et al.Asatone prevents acute lung in-jury by reducing expressions of NF-κB，MAPK and inflammatory cytokines[J].Am J Chin Med，2018，46（3）：651-671.

[12] Xu C，Guo Z，Zhao C，et al.Potential mechanism and drug candidates for sepsis-induced acute lung injury[J].Exp Ther Med，2018，15（6）：4689-4696.

[13] 蔡宛如，洪輝華，駱仙芳，等. 芪冬活血飲對油酸致大鼠急性肺損傷干預作用的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（9）：830-832.

[14] Wang P，Jiang L，Zhou N，et al.Resveratrol ameliorates autophagic flux to promote functional recovery in rats after spinal cord injury[J].Oncotarget，2018，9（9）：8427-8440.

[15] Chang C，Zhao Y，Song G，et al.Resveratrol protects hippocampal neurons against cerebral ischemia-reperfusion injury via modulating JAK/ ERK/STAT signaling pathway in rats[J].J Neuroimmunol，2018，315（2）：9-14.

[16] 鄧廷志，李富林，陳烈鉗，等.白藜蘆醇對腎細胞癌ACHN細胞增殖與凋亡的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2019，33（9）：865-868.

[17] 楊劍榆，黃曉雷，李保珍，等.白藜蘆醇通過抑制NF-κB活性減輕大鼠腸缺血再灌注繼發(fā)性肺損傷的實驗研究[J].中國臨床新醫(yī)學，2017，10（12）：1142-1145.

[18] De Oliveira MTP，De Sá CD，Tenório DSE，et al. Orally delivered resveratrol-loaded lipid-core nanocapsules ameliorate LPS- induced acute lung injury via the ERK and PI3K/Akt pathways[J]. Intern J Nanomed，2019，14（6）：20.

[19] Yang L，Zhang Z，Zhuo YZ，et al. Resveratrol alleviates sepsis-induced acute lung injury by suppressing inflammation and apoptosis of alveolar macrophage cells[J].American J Translat Res，2018，10（7）：30.

[20] 于紅，朱冬菊.白藜蘆醇對急性肺損傷小鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和肺血管內(nèi)皮的影響[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2018，45（18）：3380-3385.

（收稿日期：2020-10-28）