4-羧基苯硼酸改性殼聚糖-羥基磷灰石吸附維生素B12

李葉惠 李曉寧 王 祥 王海軍

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

維生素B12是一組類皮質醇化合物，屬于天然抗氧化劑，其作為輔酶在促進碳水化合物和正常脂肪代謝中起重要作用、同時它在紅細胞形成、神經系統的正常工作和甲基的易位方面也發揮重要作用。然而，由于維生素B12多由菌類發酵生產，具有雜質種類多，含量低的缺點，其分離純化具有挑戰性。

本研究擬通過結合固相萃取和濁點分離，建立一種新型且生態友好的維生素B12分離純化工藝。通過對殼聚糖加載量，pH及吸附時間等因素進行考察，對其吸附行為進行研究。并通過濁點分離對維生素B12進行純化。為更經濟、環保、實用的分離和純化維生素B12提供了新的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

維生素B12發酵液由華北制藥有限公司提供；維生素B12標準品，色譜級，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜級，美國Sigma公司；四水硝酸鈣，磷酸氫二鈉，脲，殼聚糖，4-羧基苯硼酸，硼氫化鈉，磷酸氫二鉀，苯六酸，乙酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司(中國上海)。

HR-200分析天平，廣州市艾安得儀器有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，常州市偉嘉儀器制造公司； TU-1950紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；N-1100旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；KQ-500D臺式數控超聲清洗儀，東莞市科橋超聲波設備有限公司； Ultimate 3000 RS超高效液相色譜儀，Nicolet iS50 FT-IR傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；D2 PHASER X射線衍射儀，德國布魯克AXS有限公司。

1.2 吸附劑的制備

1.2.1 殼聚糖-羥基磷灰石(CS/HAP)的制備

將1.5 g殼聚糖、1.416 g四水硝酸鈣和1.288 g磷酸氫二鈉完全溶解于60 m去離子水中，保證Ca/P=1.67，滴加適量硝酸使得pH=2.5。將0.126 g苯六酸和2 g脲加入溶液中，并在實驗下攪拌30 min，然后將溶液轉移至襯有聚四氟乙烯的高壓反應釜，并在150 ℃下保溫5 h。冷卻至室溫后，用去離子水和無水乙醇沖洗3次，然后放入80 ℃真空干燥箱中干燥24 h[1]。

1.2.2 4-羧基苯硼酸改性殼聚糖-羥基磷灰石

將1.50 g4-羧基苯硼酸(CPBA)溶于30 mL 0.1 mol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液。然后加入2.97 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2.97 g的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在40 ℃下活化羧基45 min，然后冷卻至室溫。隨后，用0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液將上述溶液pH調至7.0。將0.3 g的CS/HAP混合物添加到混合溶液中超聲分散處理5 min后室溫攪拌5 h，所獲得的CPBA-CS/HAP通過減壓抽濾收集，并用去離子水和二甲基甲酰胺各洗滌三次。最后將CPBA-CS/HAP置于真空干燥箱80 ℃真空干燥24 h。

1.3 吸附劑的表征方法

1.3.1 傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)

將材料放在80 ℃的真空干燥箱中干燥12 h后，取約為樣品量50倍的KBr混合研磨均勻后進行固體壓片，通過FT-IR分析其結構，掃面范圍為4000～400 cm-1。

1.3.2 X射線衍射儀(XRD)

材料的晶化狀況由X射線衍射儀進行分析，測試條件為：掃描范圍5～80°，掃描速度5°/min，Cu靶輻射，光管功率為2.2 kW。

1.3.3 熱重分析(TGA/DTG)

采用瑞士梅特勒-托利多1100SF型熱重分析儀對HAP和HAP/CS進行測量，分析其質量與溫度的關系。測試條件為以氮氣為載氣，流量30 mL/min，升溫速率10 ℃/min，升溫范圍為50～800 ℃。

1.3.4 全自動比表面積及微孔物理吸附儀(BET)

4-羧基苯硼酸改性后殼聚糖/羥基磷灰石的比表面積、孔容和孔徑通過美國麥克儀器公司ASAP2020 MP進行分析，樣品處理方法為在真空條件下，80 ℃干燥24 h后于120 ℃脫氣6 h，其表面積通過BET方程計算，孔容和孔徑通過BJH算法得到。

1.4 繪制標準曲線

精確稱量25 mg的維生素B12標準品，用去離子水溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL的標準儲備液。量取1、2、3、4、5 mL的標準儲備液置于10 mL具塞試管中，用去離子水定容至10 mL，配制為100、200、300、400、500 μg/mL的測試液，并利用紫外-可見分光光度計確定最大吸收波長并繪制標準曲線，紫外掃描范圍為200～600 nm，最大吸收波長為355 nm，標準曲線方程為y=0.002 02x+0.006 9，R2=0.999 36，線性范圍0～500 μg/mL。

1.5 不同材料對維生素B12吸附的影響

0.1 g商用大孔樹脂(MR)、0.1 g粉末活性炭(AC)、殼聚糖(CS)、羥基磷灰石(HAP)、未改性殼聚糖/羥基磷灰石(CS/HAP)、4-羧基苯硼酸改性殼聚糖/羥基磷灰石(CPBA-CS/HAP)與200 mL初始濃度為1 mg/mL的維生素B12溶液混合均勻，在25 ℃下磁力攪拌吸附12 h后，在8 000 r/min離心15 min后，取上清液測定其在355 nm處的吸光度，用公式(1)計算CPBA-HAP/CS對維生素B12的吸附量Q。

Q=(Co-Ce)*V/Wo

(1)

其中Q為維生素B12吸附量，Co為吸附液初始濃度，Ce為吸附后吸附液濃度，V為吸附液體積，Wo為吸附劑質量。

1.6 不同pH下維生素的B12的吸附實驗

為了研究CPBA-HAP/CS在不同pH條件下對維生素B12的吸附性能，將一定量的CPBA-HAP/CS粉末(0.1 g)與200 mL初始濃度為1 mg/mL的維生素B12溶液混合均勻，利用HCl和NaOH將溶液pH分別調至5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2，在25 ℃下磁力攪拌12 h后，在8 000 r/min離心15 min后，取上清液測定其在355 nm處的吸光度，用公式(1)計算CPBA-HAP/CS對維生素B12的吸附量Q。

1.7 不同時間下維生素B12的吸附實驗

為了研究吸附時間對吸附量的影響和CPBA-HAP/CS的平衡吸附量，將一定量的CPBA-HAP/CS粉末(0.1 g)與200 mL初始濃度為1 mg/mL的維生素B12溶液混合均勻，在25 ℃下磁力攪拌吸附不同時間(30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390 min)。吸附完成后，在8 000 r/min離心15 min 后，取上清液在355 nm處測定吸光度，用公式(1)計算CPBA-HAP/CS對維生素B12的吸附量，并對吸附結果進行擬合。

2 結果與分析

2.1 吸附劑的表征

2.1.1 FT-IR分析

紅外光譜如圖1所示，其中3 436 cm-1處的吸收峰與O-H和N-H的拉伸振動有關。2 912 cm-1處吸收峰為殼聚糖的吡喃糖環，600 cm-1,563 cm-1,465 cm-1的吸收峰歸因于HAP中O-P-O的彎曲振動，956 cm-1和1 029 cm-1處吸收峰為HAP中O-P伸縮振動。由曲線a可以看出在1 380 cm-1，1 076 cm-1處出現新的吸收峰為B-O的伸縮振動和C-B的拉伸振動。

圖1 CPBA-HAP/CS(a)、HAP-CS(b)、CS(c)、HAP(d)的紅外光譜Fig. 1 Infrared spectrum of CPBA-HAP/CS(a)、HAP-CS(b)、CS(c)、HAP(d)

2.1.2 XRD分析

在2θ=25.8、31.7、32.1、32.8、33.9、39.8、46.6、49.3°呈明顯的晶體衍射峰且與標準卡片(JCPDS編號72-1243)一致，這表明所制備的固體為六邊形HAP。同時在HAP/CS的圖像中出現了2θ=20°的CS特征峰，這說明復合物已經被成功制備而不是原料的單純混合。比較CPBA-HAP/CS和HAP/CS的XRD圖譜(圖2)，發現4-羧基苯硼酸的官能化對于HAP部分的晶格沒有明顯變化，但CS的結晶度明顯降低，這說明4-羧基苯硼酸是接在了殼聚糖上。

圖2 CPBA-HAP/CS(a)、HAP/CS(b)、HAP(c)和CS(d)的XRD圖Fig. 2 XRD of CPBA-HAP/CS(a)、HAP/CS(b)、HAP(c)and CS(d)

2.1.3 TGA分析

羥基磷灰石具有相當好的熱穩定性，在110 ℃ 左右出現輕微失重，這與材料物理吸附的水分子有關，材料本身未出現明顯熱解行為。CPBA-HAP/CS的熱穩定性較差，這主要是因為殼聚糖在高溫下易分解。110 ℃時0.85%的失重是由水分蒸發引起的，在230 ℃～450 ℃的失重與殼聚糖的分解有關。

2.1.4 N2吸附-脫附分析

通過全自動比表面積及微孔物理吸附儀(BTE)對HAP以及CPBA-HAP/CS的結構進行分析，N2吸附-脫附等溫線如圖3所示。從圖中可以看出在整個相對壓力范圍內，吸附-脫附等溫線為Ⅳ型，說明吸附劑是一種介孔結構[2]。

圖3 N2吸附-脫附等溫線Fig. 3 N2 adsorption desorption isotherm

2.2 不同材料對維生素B12吸附量的影響

研究不同材料對維生素B12的吸附，結果表示4-羧基苯硼酸改性殼聚糖-羥基磷灰石材料吸附量為30.47 mg/g,其中商用大孔樹脂為10.6 mg/g。

2.3 不同pH對維生素B12吸附量的影響

由圖4可見，維生素B12的吸附量在pH=6.2時達到最大，pH=5.4時吸附量的明顯減少是因為殼聚糖/羥基磷灰石在酸性條件下容易溶解。

圖4 不同pH對維生素B12吸附量的影響Fig. 4 Effect of different pH on adsorption capacity of vitamin B12

2.4 不同時間對維生素B12吸附的影響

由圖5可見，維生素B12的吸附量隨時間的增加而增加，在360 min達到平衡。

圖5 不同時間對維生素B12吸附的影響Fig. 5 Effect of different time on vitamin B12 adsorption

3 結論

本研究開發了一種苯硼酸改性殼聚糖-羥基磷灰石，有效地從維生素B12原液中特異性吸附維生素B12。以苯硼酸改性殼聚糖/羥基磷灰石復合材料(CPBA-CS/HAP)為吸附劑，在pH=6.2，溶液濃度為1 mg/g，吸附時間為360 min的條件下，最大吸附量為42.6 mg/g。