5-甲酰基尿嘧啶合成工藝研究

詹慶明 席 銳 葉俊文 龍 艷 楊維清

(西華大學 理學院，四川 成都 610041)

在人類的基因組中發現了具有多種修飾作用的嘧啶，其中嘧啶[1]和N6-甲基腺嘌呤(6 mA)起著最主要的修飾作用[2]。由于5-甲酰基嘧啶在DNA遺傳學方面有著非常重要的作用，了解其在表觀遺傳學中的各種信息，可以更加直觀的增加對遺傳調控甚至疾病治療方面的理解[3]。5-甲酰基尿嘧啶(5fU)作為DNA中的一種修飾5-甲酰基胞嘧啶的核堿基對應物也開始受到越來越廣泛的關注[4-6]。

5-甲酰基尿嘧啶現有的合成方法主要有：(1)5-甲基尿嘧啶與過硫酸鈉溶于水中，然后在85～90 ℃下反應9 h，但是該方法會產生大量副產物，導致產物分離較為困難，且該方法得到合格產品的收率較低；(2)由5-羥甲基尿嘧啶氧化羥甲基得到5-甲酰基尿嘧啶，但是該方法對催化劑的要求較高，容易產生副產物5-羧基尿嘧啶，從而降低反應收率。本文采用尿嘧啶為原料，與多聚甲醛反應進行羥甲基化，再與硝酸鈰銨進一步反應制備得到5-甲酰基尿嘧啶。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

多聚甲醛，硝酸鈰銨，高錳酸鉀，二氧化錳，三乙胺，甲醇，無水乙醇，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亞砜(DMSO)，均購置于成都科龍試劑公司；尿嘧啶購置于上海麥克林生化科技有限公司。所有試劑未經處理直接使用。去離子水為實驗室自制二次水。數據分析采用：核磁共振儀，AVANCE NEO 400，布魯克(北京)科技有限公司。

1.2 5-羥甲基尿嘧啶的制備

取20 mL去離子水加入到50 mL單口圓底瓶中，加入尿嘧啶(0.56 g, 5 mmol)和多聚甲醛(0.18 g, 6 mmol)，不斷攪拌，滴加1 mL三乙胺，緩慢加熱到90 ℃，薄層色譜實時監測反應進度(展開劑V二氯甲烷∶V甲醇=10∶1)，原料尿嘧啶反應完全后，減壓濃縮至5 mL，再加入15 mL 95%乙醇，室溫下靜止30 min，再在4 ℃下靜置4 h，過濾出沉淀，再用5×15 mL 95%乙醇洗滌5次，收集固體沉淀。60 ℃下烘干，得到目標產物5-羥甲基尿嘧啶(化合物2)(圖1)。白色固體0.65 g，產率91%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) 11.05 (s, 1H), 10.71 (s, 1H), 7.24(s, 1H),4.85 (t,J=5.5 Hz, 1H), 4.11 (dd,J= 5.5, 1.1 Hz, 2H)。

圖1 5-羥甲基尿嘧啶的制備Fig. 1 Preparation of 5-hydroxymethyluracil

1.3 5-甲酰基尿嘧啶的制備

將化合物2(0.3 g, 2 mmol)加入到15 mL水中，加熱至70 ℃攪拌溶解，再加入硝酸鈰銨 (2.3 g, 4 mmol)，不斷攪拌溶解，溶解完全后加熱升溫至回流，反應4 h。待溶液變為淺黃色為止。薄層色譜實時監測反應進度(展開劑V二氯甲烷∶V甲醇=10∶1)，反應完全后，冷卻至室溫，減壓濃縮液體至剩余約5 mL，此時已有白色固體析出，然后在2～4 ℃下冷藏過夜，抽濾出固體，并用3×10 mL丙酮洗滌沉淀3次，干燥得到固體產品如圖2所示。白色粉末0.23 g，產率83%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ11.92 (s, 1H), 11.52 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 8.14 (s, 1H)。

圖2 5-甲酰基尿嘧啶的制備Fig. 2 Preparation of 5-formyluracil

2 結果與討論

本文首先采用羥甲基化反應，在尿嘧啶的5位引入一個羥甲基得到中間化合物5-羥甲基尿嘧啶，然后根據制備得到的5-羥甲基尿嘧啶繼續反應來制備5-甲酰基尿嘧啶。對后一個反應(圖2所示)考查了反應時間、溶劑、溫度、催化劑等四類條件。

首先以水作為溶劑，70 ℃下反應2 h，考察不同氧化劑存在下的反應效果。實驗結果表明：在相同反應溶劑、反應時間、反應溫度的條件下，高錳酸鉀和二氧化錳作氧化劑時，都沒有明顯發現生成目標化合物；而硝酸鈰銨作為氧化劑時，有目標產物的生成，收率可以達到38%。可能的原因是高錳酸鉀和二氧化錳的氧化性太強，將羥甲基氧化成了羧基，因此沒有發現目標產物。

然后以水作為溶劑，硝酸鈰銨(CAN)作為氧化劑，考察不同反應溫度、反應時間條件下的反應效果。實驗結果表明：在相同溶劑和氧化劑的條件下，時間相同時，溫度由70 ℃升高到90 ℃，目標化合物的產率由41%增加到74%；相同溫度的條件下(90 ℃)，反應時間由2 h增加到4 h，目標化合物的產率由74%增加到79%。可能是因為隨著時間的增加，催化劑的有效作用時間增加，因此產率會增加；而溫度的升高會增加氧化劑的活性，催化效果更好，產率增加。

最后以硝酸鈰銨(CAN)作為氧化劑，回流條件下反應4 h，考察不同反應溶劑的反應效果。實驗結果表明：分別以水、甲醇、乙醇作為溶劑，在常壓回流條件下反應，收率分別為83%、19%、22%。然而，在相同時間(4 h)、溫度(100 ℃)和氧化劑(CAN)的條件下，H2O、DMF、DMSO反應效果都較好(收率分別為83%、77%、81%)，可能是因為這三種溶劑對反應底物溶解性較好的原因。但由于H2O、DMF、DMSO反應效果差別不是特別顯著，考慮環保、經濟性等因素，最終我們選擇以H2O作為反應溶劑。

3 結論

本文研究開發了一種新的合成5-甲酰基尿嘧啶的方法：以尿嘧啶為起始原料，在三乙胺為堿的條件下，與多聚甲醛反應制備得到中間化合物5-羥甲基尿嘧啶，收率可以達到91%；再以該中間體為底物進行氧化反應，制備得到5-甲酰基尿嘧啶，在最優條件下該反應收率可以達到83%。重點考察了氧化反應步驟中，氧化劑、反應時間、反應溫度對產物收率的影響。在最優反應條件下，以尿嘧啶為起始原料，兩步反應總收率可以達到75%以上。該方法操作簡單易實施，反應條件溫和，收率高。本文研究獲得了5-甲酰基尿嘧啶的合成新工藝，該工藝原料易得，反應條件溫和，收率高。并對目標產物采用核磁共振進行了結構表征。