分光光度法檢測奧貝膽酸與白藜蘆醇聯合在脂肪肝細胞的作用

高 川 付海洋 劉 敏 周奎臣

(1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154007)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)包括了非酒精性脂肪肝(NAIL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NASH疾病發展嚴重時可導致肝硬化、肝細胞癌(HCC)，必要時須進行肝臟移植。近些年來，NAFLD的發病率越來越高，NASH患病率也進一步增加,并且NAFLD尚無公認的特效治療方法[1，2]。奧貝膽酸(Obeticholic acid，OCA)，是法尼酯 X受體(Farnesoid X receptor, FXR)的天然配體，能夠調節肝臟脂質，促進細胞再生，保護肝臟，但其存在瘙癢等不良炎癥反應[3]。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)具有很好的抗炎癥、抗氧化效果[4]。SOD和MDA是評價氧化應激的兩個指標，檢測方法有ELISA、蛋白凝膠電泳、分光光度法等。本文用分光光度法檢測OCA聯合RSV在NAFLD細胞模型上的應用，以評價抗氧化應激和降脂效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藥品：奧貝膽酸(廈門海樂景生化有限公司);白藜蘆醇(上海邁瑞爾化學技術有限公司)；試劑：游離脂肪酸(棕櫚酸∶油酸=1∶2，棕櫚酸：天津市科密歐化學試劑有限公司，油酸：西隴科學股份有限公司);MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

儀器：紫外可見分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司)。

1.2 實驗對象

以HepG2細胞為實驗對象，調節細胞密度為1×105/mL，加入24孔培養皿中培養24 h。

1.3 藥物干預

細胞貼壁后，加入正常培養基的為對照組(CON),其余組在均加入含有500 μmol/L游離脂肪酸的培養基后，分為模型組(MOD)、聯合用藥組(OCA+RSV)、奧貝膽酸組(OCA)，每組3個復孔，繼續培養24 h；各給藥組加入各藥物的濃度為5 μmol/mL，繼續培養24 h。

1.4 結果檢測

培養完成后，取各組的培養液300 μL分別裝在1.5 mL的EP管中，4 ℃保存備用。

1.4.1 油紅染色

藥物作用后各孔除去培養液并用PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定10 min；吸去多聚甲醛再用PBS洗滌2次，用60%的異丙醇溶液洗滌細胞1 min；去除異丙醇溶液加入油紅染色液染色10 min；加入蒸餾水終止染色，吸去液體在倒置顯微40×10倍鏡下觀察細胞脂質結果，如圖1。

1.4.2 氧化應激檢測

取備好的細胞培養液100 μL，按照試劑盒說明配液，利用分光光度儀檢測吸光度，MDA在532 nm、SOD在550 nm處有最大吸收，計算出細胞培養液中SOD和MDA的含量。

1.5 數據統計處理

2 結果

各組細胞的油紅染色結果顯示(圖1)，在游離脂肪酸刺激下細胞脂質增多，加入藥物的兩組差別不大，都對細胞的脂肪變起到一定的抑制效果，與模型組對比，細胞脂質均明顯減少。

圖1 油紅染色結果

分光光度法檢測MDA含量精確度可達0.01 nmol/mL,SOD活性值精確度達0.01 U/mL。經檢測，OCA能夠降低MDA含量和SOD活性，均值分別為17.75 nmol/mL和32.66 U/mL。但聯合用藥的效果更好，MDA含量均值為9.38nmol/mL，SOD活性降低也較明顯。P<0.05，差異均有統計學意義。

表1 各組SOD和MDA檢測結果

3 討論

NAFLD是全球發病最高的慢性肝病，發病機制主要以“二次打擊學說”為主。“第一次打擊”是由于肥胖、糖尿病等因素導致肝臟中脂肪堆積，形成單純性脂肪肝，“第二次打擊”是由于炎癥、氧化應激、脂肪因子調節紊亂等因素對肝臟的損傷，嚴重時可導致NASH 甚至纖維化等[5]。迄今為止，依然沒有治療本病的特效西藥，臨床大多從抗氧化、保護肝細胞、抗炎、調脂等方面進行治療，但單一的治療方法并不能取得很好的治療效果。

奧貝膽酸為一種特異很強的FXR受體激動劑，該藥臨床上主要應用于膽汁性膽管炎[6]，在NAFLD的治療中取得一定療效。目前該藥還處于臨床試驗階段，目前發現其有皮膚瘙癢、血脂異常等副作用，預計通過對其結構的改良升級或采取聯合用藥等方式可改善其副作用并拓寬用藥范圍，有望應用于NAFLD患者的臨床治療[7]。

白藜蘆醇作為天然抗氧化劑，降低MDA水平，可增加細胞內SOD分子的表達，與細胞代謝及壽命具有緊密聯系，同時研究顯示其還具有顯著的抗感染、抗腫瘤、抗高脂血癥等活性[8]。

綜上所述，本文選用分光光度法檢測OCA和RSV聯合用藥作用于HepG2細胞非酒精性脂肪肝模型的作用。聯合用藥能夠降低細胞的脂肪變，同時降低細胞發生脂肪變時的氧化應激反應，減少細胞損傷和死亡，比單獨使用OCA取得更好的療效，有進一步進行深入研究的價值。