一種豬偽狂犬病病毒gE基因TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

任玉鵬，納 吉，向 華，向 萌，王一丹

（西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus, PRV）引起的豬的一種急性接觸性傳染病。除豬外，犬、貓和其他多種家畜均為其易感動物。PRV對各年齡豬只均可引起發病，以引起呼吸困難、神經癥狀和繁殖障礙為特征，特別是導致母豬流產，仔豬感染死亡率可達100%，危害極為嚴重[1]。我國長期通過免疫接種、抗體監測等手段持續對PRV進行防控和凈化，這使得豬偽狂犬病疫情在一定程度上得到控制。但是，近年來我國PRV免疫失敗的案例層出不窮，具體表現為免疫PRV Bartha-k61基因缺失疫苗的豬群再次出現感染，并且其發病率和死亡率呈現明顯上升趨勢，給我國PRV的防控帶來新的挑戰[2]。

對當前流行的PRV毒株分子特征研究結果表明，流行株基因組出現了不同程度的遺傳變異，特別是自2011年后，PRV變異株的出現導致其在國內流行趨勢逐步上升。近年來，在四川、河南、湖北和廣東等多地均有PRV流行的報道[3]。對PRV變異株主要毒力基因測序分析發現，變異株與經典毒株處于不同的分支，經典毒株屬于基因1型，變異株多為基因2型，在gB、gC、gD和gE基因均存在一定程度的遺傳變異[4-5]。如gB基因的遺傳變異多分布于其重要抗原表位（59～279氨基酸）區域，這可能是導致毒株部分抗原性改變的重要原因[6-7]。此外，高映雪等[8]對2013—2018年國內流行的64個毒株測序分析發現，所有毒株與經典株相比在gE基因均出現不同程度的變異，特別是第48位氨基酸處均存在1個天冬氨酸（D）插入。由于gE基因是PRV重要的毒力基因，上述氨基酸變異是否對病毒毒力產生影響值得進一步研究。同時，gE基因作為PRV重要分子檢測靶點，是野毒株與基因缺失疫苗株的重要鑒別基因，該基因的核苷酸變化可能會導致部分已有檢測方法的靈敏性下降[9]。所以，新的PRV分子檢測方法有必要建立。

本研究擬建立一種基于TaqMan熒光定量PCR技術的PRV分子檢測方法，以PRV的gE基因作為靶向基因設計特異性引物和探針，達到有針對性檢測PRV野毒株的目的。同時對該方法的反應體系及條件進行優化，評估其敏感性、特異性和穩定性，并比較其與商品化試劑盒檢測符合率，以期為PRV野毒株的快速檢測提供可靠手段。

1 材料與方法

1.1 菌毒株及樣本

試驗于2020年7—12月在西南民族大學畜牧獸醫學院動物醫學實驗室進行。PRV Bartha-k61疫苗株購自某實業股份有限公司；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細小病毒（PPV）、豬A群輪狀病毒（PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬鏈球菌（S.suis）、豬源大腸桿菌（E.coli）、豬源巴氏桿菌（P.multocida）、豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis）和葡萄球菌（S.aureus）等用于特異性檢驗的菌毒株及核酸樣本信息見表1；用于符合率檢測的50份PRV已知陽性樣本核酸及40份已知陰性樣本核酸由西南民族大學動物醫學實驗室保存。

表1 菌毒株信息及來源

1.2 主要試劑

TIANamp Virus DNA/RNA kit和TIANamp Bacteria DNA kit購自天根生物科技（北京）有限公司；豬偽狂犬病病毒（gE基因）實時熒光PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防控技術有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物及探針的設計

用Maga 7.0對NCBI上登錄的多個PRV毒株gE基因序列（KJ789182.1、MN240565.1、MK622299.1、MH507059.1、KU962917和KX170935.1）進行比較，通過對比分析找到gE基因的保守區域，采用Primer 5.0設計PRV gE基因長片段（562 bp）擴增引物（P1/P2）用于構建質粒標準品；進一步在該區域內用Beacon Designer 8設計用于檢測方法建立的特異性引物（P3/P4）及探針（表2）。上述引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 PRV擴增引物

1.4 核酸提取

將病毒液和菌液各取200 μL，按照TIA Namp Virus DNA/RNA kit和TIANamp Bacteria DNA kit的操作指南，對包括PRV SC-5株（Vero細胞毒）在內的所有毒株菌核酸進行提取，并將抽取的樣品放置在-80 ℃下保存。

1.5 質粒標準品的構建

分別對PRV SC-5株核酸進行PCR擴增，反應總體系為50 μL，Premix Ex TaqTM25 μL、上下游引物（P1/P2）均為1 μL、模板2 μL，dd水補足至50 μL。反應條件：94 ℃ 2 min，（94 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 35 s）循環30次，72 ℃ 10 min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

根據Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0試劑盒說明書對目的片段進行回收純化，然后根據pMD19-T載體說明書進行產物連接并轉化至E.coliDH5α感受態細胞中。將重組菌涂布接種于含有Amp的LB平板，取陽性克隆進行測序鑒定，將其命名為：pGEM-T-PRV。利用NanoDrop 2000測定質粒標準品的濃度并根據公式拷貝數（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×濃度（ng/μL）/MW（g/mol），MW為平均分子量，計算核酸標準品的拷貝數。

1.6 反應條件的優化

以步驟1.5中所獲得的度為104copies/μL的pGEM-T-PRV標準品為模板，按照單一變量原則，進行熒光定量RT-PCR反應條件和體系的優化。在反應體系中加入引物P3/P4，使其終濃度分別為0.2、0.4、0.6、1 μmoL/L；加入探針使其終濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.5 μmoL/L，根據擴增曲線和熒光強度值進行引物和探針濃度的優化。采用最佳引物和探針濃度，在退火溫度分別為56、58、60、62 ℃下進行反應，最終確定最優體系和條件。

1.7 反應條件的優化

將pGEM-T-PRV標準品進行101～107倍的稀釋，并分別作為模板進行TaqMan熒光定量RT-PCR檢測，分別以各稀釋度質粒標準品拷貝數的Log值和CT值作為標準曲線的X軸和Y軸以繪制標準曲線，確定線性關系。

1.8 特異性試驗

分別用PRV Bartha-k61株、PEDV、TGEV、PoRV、PPV、PDCoV、S.suis、E.coli、P.multocida、S.choleraesuis和S.aureus等菌毒株核酸作為模板，以無菌水為空白對照，進行TaqMan熒光定量PCR反應評估檢測方法的特異性。

1.9 敏感性試驗

將已知濃度的pGEM-T-PRV標準品進行10倍梯度倍比稀釋，以各稀釋度標準品混合液為模板，按照最佳反應條件進行一步法多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應，以評價該方法的靈敏性。

1.10 重復性試驗

以步驟1.9中稀釋至103、105和107拷貝數的pGEM-T-PRV為模版，進行3次TaqMan熒光定量RT-PCR反應，每次試驗設置3次重復，以評價該方法組內和組間的重復性，并將試驗結果進行統計學分析。

1.11 與商品化檢測試劑盒比較檢測符合率

用本研究建立的方法與PRV實時熒光PCR檢測試劑盒進行比較。同時檢測50份已知PRV野毒感染陽性樣本和40份PRV陰性進行檢測，通過2×2列聯表法進行統計學分析計算符合率和Kappa值，評價該方法檢測結果與商品化檢測試劑盒的一致性。

2 結果

2.1 質粒標準品的鑒定

對pGEM-T-PRV重組質粒進行PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳后，出現與預期大小相符的、大小約560 bp的目的條帶（圖1）。對重組質粒的測序并經Blast比對分析，結果與已登錄參考PRV毒株gE基因序列同源性為100%，表明質粒標準品構建成功。

圖1 PCR產物電泳結果

2.2 反應條件的優化

經優化結果表明，在PRV上下游引物濃度均為0.2 μmol/L，探針濃度為0.05 μmol/L、退火溫度為58 ℃時，擴增曲線為S型光滑曲線，表明此為最佳反應體系和條件（圖2）。

圖2 優化后的熒光定量PCR檢測結果

2.3 標準曲線的建立

以10倍倍比稀釋的標準品濃度的Log值為X軸，以CT的值為Y軸繪制標準曲線（圖3）。結果表明，該方法對標準品的擴增呈現良好的線性關系，其線性關系表達式分別為：y=-3.481 8 x+36.699，R2=0.995 5。

圖3 熒光定量PCR的標準曲線

2.4 TaqMan熒光定量PCR的特異性

用本試驗建立的PRV（gE）熒光定量PCR檢測方法對PRV疫苗株、PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PPV、S.suis、E.coli、P.multocida、S.choleraesuis和S.aureus進行檢測，其CT值均≥38或無熒光信號，表明該方法具有良好的特異性。

2.5 TaqMan熒光定量PCR的檢測下限

將PRV質粒標準品進行1 0倍梯度稀釋（101～1011），然后進行TaqMan熒光定量PCR進行檢測，結果顯示PRV最低檢測下限為3.92 copies/μL（圖4），表明該方法具有良好的敏感性。

圖4 熒光定量PCR法對10倍梯度稀釋質粒的檢測結果

2.6 重復性檢測

重復性評估結果表明，無論是組內重復試驗還是組間重復試驗的變異系數（CV）均≤2%，表明該方法重復性和穩定性良好（表3）。

表3 PRV的重復性檢測結果

2.7 符合率比較

用商品化的PRV（gE）熒光定量檢測試劑盒與本研究構建TaqMan熒光定量PCR同時對50份PRV已知陽性樣本核酸及40份已知陰性樣本進行檢測。結果表明，兩種方法對所有樣本的檢測符合率為100% （k=1）。

3 討論

傳染病病原精準快速診斷對疫病監測預警和在早期防控過程中制定有針對性的政策措施具有重要意義。分子生物學診斷技術是實驗室診斷中最常見和可靠的技術手段。其中PCR、熒光定量PCR和巢式PCR技術是世界動物衛生組織（OIE）推薦的非洲豬瘟、藍耳病、豬瘟、偽狂犬病等豬重大疫病病原檢測的常用技術[10]。而在所有的分子生物學檢測技術中，熒光定量PCR具有高效、特異、靈敏、可定量、高通量、操作簡便和無污染等一系列優點，在病原學檢測中得以廣泛應用。尤其是特異性TaqMan探針在熒光定量PCR中的應用，進一步提高了檢測的特異性和靈敏度，適用于低拷貝數的臨床樣本檢測[11]。因此，本研究采用探針法熒光定量PCR技術建立針對PRV野毒株的快速檢測方法是其具有良好靈敏性和特異性前提和保證。此外，目前PRV基因結構約有近95% 已被定位和測序。PRV基因組編碼近100種蛋白質。其中編碼gE蛋白的基因是病毒復制的非必須毒力基因，其編碼的囊膜蛋白質可促進感染細胞和臨近感染細胞的膜融合，從而促進病毒的擴散，gE基因的缺失會導致病毒的嗜神經性毒力降低[12]。當前對PRV基因缺失疫苗的研究中，多采用確實gE、TK、gB等毒力基因的策略進行缺失株的構建。因此，對gE基因的檢測可以實現只針對PRV野毒株的檢測，而不對基因缺失疫苗株進行檢出，可達到防止假陽性結果的目的。

本研究對PRV gE基因片段保守區域設計一對特異性的引物和探針，對反應體系和條件進行了充分優化，建立了一種檢測PRV野毒株的TaqMan熒光定量PCR方法。結果表明，在上下游引物濃度分別為0.2 μmol/L、探針濃度為0.05 μmol/L、退火溫度為58 ℃時擴增效果最佳，該方法檢測下限可達到3.92 copies/μL，具有較高的敏感性。對包括PRV基因缺失疫苗在內的11種豬病相關的細菌和病毒株均無非特異性擴增，特異性良好。同時，該方法與商品化試劑盒同時檢測已知陽性和陰性樣本，結果符合率為100%，表明該方法檢測結果可靠，可以初步用于臨床樣本的檢測。本研究建立的PRV TaqMan熒光定量PCR方法可以為豬偽狂犬病的快速診斷和流行病學調查提供可供選擇的工具。