利用SNP標記分析淳安花豬群體遺傳多樣性和群體結構

戴麗荷，褚曉紅，陳曉宇，楊娜娜，黃孫平，徐如海

（浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所/浙江省畜禽遺傳育種工程技術研究中心，浙江 杭州 310021）

淳安花豬是浙江省地方豬品種之一，原產于淳安縣境內，距今有500多年的飼養歷史。1980年，淳安花豬與安徽的皖南花豬歸并，稱為皖浙花豬[1]。淳安花豬具有大多數中國地方豬種的特點，如繁殖力強、肉質優良、耐粗飼、生長速度慢、瘦肉率低等，曾是當地農戶飼養的當家豬種，1983年全縣淳安花豬能繁母豬存欄量達到8 319頭。但由于地方豬普遍存在生長速度慢、瘦肉率低等特點，加上近30多年來瘦肉型豬種的沖擊，淳安花豬飼養量急劇減少，2005年存欄僅248頭，已瀕臨滅絕[2]。

要評估豬保種群體的現狀，最重要的是分析當前群體的遺傳多樣性。目前豬群體遺傳多樣性的評估最常使用的是SNP（單核苷酸多態性）分子標記。SNP標記具有密度高、遺傳穩定、可自動化分析等特點，在豬、雞等畜禽上都有相應的SNP芯片。隨著SNP芯片技術的成熟和價格的降低，SNP芯片愈來愈廣泛地應用于豬的遺傳多樣性分析以及其他遺傳學研究中[3-7]。

近年以來，淳安花豬的生存形勢愈加嚴峻，現有保種群體幾經變動，系譜記錄缺失，養殖數量繼續下降。目前淳安花豬保種群體的遺傳多樣性如何？群體近交情況怎么樣？家系數量到底有幾個？能否重構群體系譜？只有解決這些問題，才能更科學有效地保護淳安花豬這一寶貴地方豬種。本研究就是利用SNP芯片技術鑒定淳安花豬保種群體中現有的全部能繁公母豬的個體SNP位點，在此基礎上分析淳安花豬群體的遺傳多樣性和親緣關系，并重新劃分家系，以指導淳安花豬種群后續的恢復擴群以及種質資源保護工作。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2021年4月13日至6月30日，在浙江省杭州市淳安縣采集54頭浙江省杭州市淳安縣淳安花豬現有保種群全部能繁公母豬的前腔靜脈血樣，其中母豬47頭，公豬7頭，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 淳安花豬群體基因組DNA的提取 采用磁珠法血液DNA提取試劑盒（康為世紀，CW2531S）提取淳安花豬的DNA。所有樣品的DNA利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000進行定量分析，DNA的濃度調整至50 ng/μL。

1.2.2 SNP芯片分型 所有合格的DNA樣品利用Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片進行基因型分型，然后對獲得的芯片掃描數據按以下標準進行質控：先除去性染色體上的標記，只使用常染色體上的位點，再選擇SNP檢出率大于0.9、個體檢出率大于0.9的位點，進行后續分析。

1.2.3 遺傳多樣性分析 遺傳多樣性分析包括有效群體含量（Effective population content, Ne）分析[8]、群體的多態性標記比例（Proportion of polymorphic marker, PN）分析[9]、群體的期望雜合度（Expected heterozygosity, He）和觀察雜合度（Observed heterozygosity, Ho）分析[10]。利用Plink（V1.90）軟件分析多態性標記比例、期望雜合度和觀察雜合度，利用SNeP（V1.1）軟件分析群體有效含量。

1.2.4 種群基因組親緣關系分析 利用Plink（V1.90）軟件計算個體間的遺傳距離，構建狀態同源（identity by state, IBS）矩陣，進行IBS遺傳距離分析。通過全基因組標記信息構建基因組關系G矩陣[11]，利用Gmatrix（V2）軟件進行G矩陣分子親緣關系分析，繪制熱圖展現個體之間的基因組親緣關系。

1.2.5 基于長純合片段的近交系數分析 使用Plink1.9b軟件進行基因組長純合片段（Runs of homozygosity, ROH）分析。首先使用Plink（V1.90）計算得到每個樣本的ROH長度[9]，然后通過計算個體中ROH片段的總長度占常染色體基因組總長的比例得到基于ROH的近交系數[12]。

1.2.6 聚類分析構建淳安花豬群體家系 基于IBS遺傳距離分析結果和G矩陣分析結果，利用Mega X（V10.0）軟件構建鄰接法進化發育樹（Neighbor-Joining tree, NJ tree），進行聚類分析，構建淳安花豬保種群體家系。

2 結果

2.1 基因組DNA檢測

54份淳安花豬DNA樣品的濃度均大于100 ng/μL，OD260nm/OD280nm為1.7～2.0，基因組DNA樣品質量較好，無蛋白質污染，也無降解，達到基因芯片的分析要求，可以用于后續研究。

2.2 SNP分型及質控

利用Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片分析54頭淳安花豬的基因組DNA，共檢測到44 739個SNPS位點，個體的基因型檢出率為98.25% ～99.14%，平均值為98.49%。通過質量控制，總共得到32 713個高質量的SNP位點，在染色體上的分布情況如表1所示。這些位點的分布密度在1號染色體最多，為3 835個，說明1號染色體的遺傳變異相對較豐富；18號染色體的SNP數目最少，為742個。

表1 質控前后的SNP在染色體上的分布

2.3 遺傳多樣性分析

54頭淳安花豬共檢測到了73.187個有效等位基因，平均有效等位基因數為1.355，最小等位基因頻率平均為0.143，分布比較均勻，其中0.1～0.2之間的相對較多，占25.05%，分布情況如圖1A。SNP位點的多態性標記比例（PN）為0.543，表明54.3% 的SNP位點具有多態性，SNP位點的多態信息含量為0.018～0.375，平均多態信息含量為0.193，其中，14 582個SNP位點的多態信息含量大于0.25（用于計算多態信息含量的SNP位點共35 679個），為中度多態性SNP位點，如圖1B所示。淳安花豬有效群體含量（Ne）為5.0，平均觀察雜合度（Ho）為0.254，平均期望雜合度（He）為0.257，平均觀察雜合度略小于平均期望雜合度，但兩者十分接近。

圖1 淳安花豬遺傳多樣性分析

2.4 IBS距離矩陣分析

54頭保種淳安花豬之間的IBS遺傳距離在0.083 3～0.388 7之間，平均為0.212 9；7頭種公豬的IBS遺傳距離在0.104 2～0.286 2之間，平均為0.233 9。淳安花豬保種群體IBS距離矩陣的結果如圖2所示，大部分方格顏色較淺（呈中等程度的親緣關系），小部分個體間的IBS遺傳距離較近，存在較高的親緣關系。

圖2 淳安花豬種群的狀態同源（IBS）矩陣

2.5 G矩陣分析

利用SNP位點構建的基因組關系G矩陣，進一步分析淳安花豬保種群體的親緣關系，結果如圖3所示。大部分淳安花豬個體間呈中等程度的親緣關系（圖3中顏色較淺的方格），而部分個體之間存在較近的親緣關系（圖3中顏色較深的方格），與IBS距離結果一致。

圖3 淳安花豬種群的G矩陣

2.6 ROH分析

在54頭淳安花豬保種群體中共檢測到2 646個ROH片段，長度在1～10 Mb之間的ROH數量最多，占72.54% （圖4A），其中，最短的ROH的長度為1.12 Mb，位于15號染色體上，最長的ROH的長度為135.85 Mb，位于13號染色體上。ROH的分布比較均勻，1號染色體上的ROH數量最多，為313個；12號染色體上的ROH數量最少，為65個（圖4B）。每頭淳安花豬的ROH總長度在2.93～1 050.05 Mb之間，平均ROH總長度為488.91 Mb，ROH總長度在400～700 Mb之間的個體數最多，共有35頭（圖4C），占65%。

圖4 淳安花豬ROH分析

淳安花豬保種群體基于ROH計算的平均近交系數為0.199，大部分集中在0.1～0.3，最低0.001 2，最高0.428 5，表明淳安花豬保種群體出現了近交現象。

2.7 淳安花豬保種群體家系結構分析

一般來講，豬保種群體的家系劃分是基于公豬。同時結合G矩陣和遺傳距離分析結果，將這7頭種公豬劃分為5個家系，分別命名為家系A、家系B、家系C、家系D、家系E，分別含有2、2、1、1、1頭種公豬。

根據47頭淳安花豬母豬與不同家系公豬親緣關系的遠近程度，將母豬劃分進上面已構建的5個公豬家系中。另外，在這5個家系分類以外，有25頭母豬與所檢測的公豬血緣關系都比較遠，將其合并構建為家系F，最終整個淳安花豬保種群體家系分析結果見表2，共分為6個家系。

表2 群體家系構建結果

3 討論

豬群體遺傳多樣性研究一般使用微衛星標記或SNP標記。章學東等[13]利用9對微衛星標記檢測淳安花豬群體遺傳多樣性，認為淳安花豬群體遺傳多樣性豐富。但隨著技術的發展，SNP芯片突顯出了更大的優勢，與微衛星標記相比，SNP標記覆蓋密度大，分布廣泛，數量豐富，突變率低，遺傳穩定性高。有研究表明，采用SNP標記比采用微衛星標記估計親緣關系的準確性更高[14]。本研究主要利用中國地方豬種的Illumina CAUPorcine 50K SNP芯片，發現個體的基因型檢出率為98.25% ～99.14%，平均值為98.49%，且這些位點幾乎覆蓋全部基因組，分布相對均勻，具有很好的代表性。利用同樣的芯片，藍塘豬個體基因型檢出率94.88% ～98.43%，平均為98.24%[7]。馬身豬個體基因型檢出率為97.75% ～98.16%，平均為98.01%[4]。這些研究表明，該款SNP芯片適用于我國地方豬種的SNP檢測。

黃樹文[5]利用SNP芯片對中國華南地區（云南、廣東、廣西、福建、海南）21個地方豬種和6個西方豬種的分析表明，27個豬種的多態性標記比例為0.795～0.995。蔡春波等[4]發現馬身豬的多態性標記比例為0.724。本研究中淳安花豬SNP位點的多態性標記比例為0.543，與第三世代青峪豬群體的0.536 7[3]基本相當，說明淳安花豬的遺傳多樣性較少。淳安花豬并沒有像西方商業豬種那樣經受過高強度的選育，但卻沒有表現出更高的遺傳多樣性，這反映了大多數中國地方豬種保種群規模較小、遺傳多樣性丟失嚴重的現象[15-16]。在雜合度方面，27個豬種的觀測雜合度為0.25～0.43，中國地方豬種中，以官莊花豬的觀測雜合度最低，為0.298；期望雜合度為0.295～0.421，中國地方豬種中，閩北花豬最低，為0.295[5]。本研究中淳安花豬的平均觀察雜合度（Ho）為0.254，平均期望雜合度（He）為0.257，均低于華南地區的地方豬種，原因可能是由于一直以來淳安花豬的保種群體小，近親繁殖普遍存在而使群體發生純合反應，導致雜合度降低。此外，淳安花豬的平均觀察雜合度略小于平均期望雜合度，但兩者十分接近，表明現有的淳安花豬群體未經受過嚴格的選育，豬群幾乎處于自由交配狀態[17]，這與近幾年淳安花豬保種群變動劇烈有關。因此，在淳安花豬保種工作中，應盡量引入新的血統，避免近親繁殖，以提高遺傳多樣性。

衡量群體遺傳關系的指標主要看遺傳距離和根據基因組G矩陣分析的親緣關系。一般來說群體遺傳距離越近，遺傳相似系數越大，則親緣關系越近[18]。陳究成[19]利用簡化基因組測序方法發現浙江省地方豬群體平均遺傳距離為0.151，其中淳安花豬遺傳距離為0.159。本研究發現淳安花豬遺傳距離為0.212 9，這與SNP標記檢測方法、樣本分析數量、保種群體變動等有關。G矩陣分析結果也同樣表明，大部分淳安花豬個體間呈中等程度的親緣關系，部分個體之間存在較近的親緣關系，與IBS距離結果一致，表明淳安花豬保種群體存在近交風險。

ROH是個體基因組內純合基因型的連續片段，蘊含著群體近交的信息，其長度和頻率可以反映群體歷史。基于ROH計算的基因組近交系數是個體真實的近交系數，不依賴于系譜記錄的準確性和完整性，能準確地反映兩個配子間的關系。本研究基于ROH值計算的群體平均近交系數為0.199，比馬身豬（0.237）[4]低，但比青峪豬（0.075）[3]、恩施黑豬（0.069）[6]和深縣豬（0.009 3）[20]都要高，表明淳安花豬群體出現了近交現象，這與IBS矩陣以及G矩陣結果相一致。后續工作中應引入新的血統，擴大群體含量，進行科學選配，避免近親繁殖。

實際育種工作中，在系譜的準確性和完整性上出現誤差或缺失很難避免，尤其是在大部分的地方豬保種場，由于規模和技術力量受限，系譜的完整性、連續性及準確性等問題尤為突出。淳安花豬保種群體由于這幾年變動較大，存在系譜缺失的情況，本研究將54頭淳安花豬分為6個家系，其中5個家系均含有種公豬，但不同家系中個體數目差異很大，家系E沒有母豬，家系F沒有公豬，在后續的保種工作中，需要關注各家系種豬的數量，盡量維持一個平衡的家系結構。

總之，淳安花豬保種群體的雜合度低，近交程度高，家系少，各家系的個體數量差異大，容易引起遺傳多樣性的丟失。結合研究結果，筆者認為切實可行的淳安花豬保種策略，一是根據家系劃分結果，在實際選配中可采取不同家系間的輪回配種，實現避開全同胞、半同胞的不完全隨機交配；二是可利用回交法造就新的公豬血統，增加群體有效含量；三是延長世代間隔，控制近交增量；四是加強檔案管理，及時建立電子檔案及規范耳號編號、系譜記錄流程，對遺傳數據做到可及時跟蹤和監測，定期分析，及時調整保種方案。本研究對淳安花豬的保種工作具有實際指導意義。