肝病患者聚合酶鏈反應法檢測血中納米細菌的臨床價值

王 楠

（大連市公共衛生臨床中心（大連市第六人民醫院），遼寧 大連 116031）

納米細菌是由芬蘭科學家所發現的微小細菌，經過調查研究發現，它不僅會感染人類，還會感染其他哺乳動物，屬于一種人獸共患的致病原。另外，納米細菌與人類多種疾病的發生都有直接關系，如結石、關節炎、動脈粥樣硬化、皮膚病、腫瘤等。有部分國外學者發現在人納米細菌存在的范圍非常廣，健康人的血清中、腎結石患者的血液、尿液中、肝病血清中等[1]。慢性肝病是我國目前常見的一種疾病，患者免疫力一旦低下就會引起引發疾病，對患者的生活質量和生命安全都造成了嚴重的影響，所以在該疾病患者中及早檢測出納米細菌，有助于為治療提供依據[2-3]。目前對肝病患者開展血清中納米細菌檢測工作時，通常是采用細菌培養、免疫組化、電鏡開展檢測工作，但這些方法操作煩瑣，耗時較長[4-5]。而聚合酶鏈反應法（polymerase chain reaction，PCR）利用特異性熒光TaqMan探針，實行完全閉管式操作，能夠有效減少擴增產物污染的機會，在敏感性、特異性與速度方面都有明顯的優勢，在臨床檢測中具有很高的應用價值。本研究主要開展血中納米細菌的檢測工作，探討聚合酶鏈反應法檢測血中納米細菌的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年1月至2019年4月入住我院并接受治療的110例肝病患者和40名同時間段接受健康體檢的人員。110例肝病患者中有慢性乙型肝炎35例、慢性丙型肝炎30例，肝炎肝硬化25例，肝癌20例；男女比例為49∶61；年齡18～76歲，平均年齡為（47±29）歲。

1.2 方法

1.2.1 ELASA法 嚴格按照試劑盒上說明書進行操作。

1.2.2 PCR技術 將10 μL血清樣本直接到存有10 μL顆粒的PCP反應管中，再加入50 μL的裂解液，將其混合均勻。震蕩30 s，之后放置在室溫的后置磁力架上，時間控制在5 min，將顆粒吸附在一側的管壁上，全部將液相吸棄。將含有顆粒的PCP反應管中加入100 μL包被液，放置在渦旋振蕩器上，讓其震30 s，在試管中進行常規靜置，時間控制在30 s，同樣使顆粒吸附在一側的管壁上，全部將液相吸棄[3]。上游引物（5′-3′）：GGA GGA ACA CCA GTG GCG AAG G；下游引物（5′-3′）：GCC CGT AAG GCA ATG AGG AC；由中國科學院上海生物工程中心合成,其擴增片段的直徑為511 bp，20 μL反應體系，Taq酶1 U。反應條件：94 ℃預變性，5 min時直接進入循環，要滿足94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的條件，在循環35個環節下，72 ℃要繼續進行延伸，時間控制在5 min，取出5 μL加入到2%瓊脂糖凝膠電泳中，在長波紫外燈下對肝病患者的情況進行觀察。

1.2.3 射電鏡掃描法 在無菌無致熱源條件下，將抗凝血漿取出，劑量為1 mL，之后用生理鹽水進行稀釋，依次經0.45 μm和0.22 μm濾膜過濾，離心45 min；取管底1 mL混勻，之后加入胎牛血清的RPMI1640培養基；混勻后,將標本放置在溫度為在37 ℃、pH值為7.40%，5%CO2和95%空氣條件下進行培養，培養時間為45 d。取部分納米細菌的培養物標本8 000 r/min離心10 min，置于0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.0）配制的2.50%戊二醛固定液及1.0%四氧化鋨固定液中進行雙同定；超薄切片經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后，在透射電鏡下進行觀察、拍照。在培養物的標本中可以發現50 nm左右和較大的細菌樣顆粒則為陽性，反之為陰性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測納米細菌陽性率結果對比 采用ELASA法檢測，肝病患者納米細菌的總感染率顯著高于健康人，差異有統計學意義（P＜0.05）；PCR技術進行檢測，肝病患者納米細菌的總感染率與健康人對比，差異有統計學意義（P＜0.05）；這2種檢測方法檢測肝病患者納米細菌感染率對比，無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種檢測納米細菌陽性率結果對比（）

表1 兩種檢測納米細菌陽性率結果對比（）

注：與健康人相比，aP＜0.05。

2.2 ELASA法及PCR技術檢測結果 通過ELASA法檢測，有90例患者呈現陽性，60例呈現陰性；通過PCR技術檢測，有110例患者呈現陽性，40例呈現陰性。見表2。

表2 ELASA法及PCR技術檢測結果（n）

2.3 兩種檢查方式結果比較 PCR技術敏感度比較明顯高于ELASA法，ELASA法特異度明顯高于PCR技術。見表3。

表3 兩種檢查方式結果比較（%）

3 討論

納米細菌屬于20世紀90年發現的一種細菌，非常微小，屬于生物學特性的一種革蘭陰性菌。該細菌呈球桿狀或，有部分呈球狀，整個直徑為50 500 mL，細菌壁較厚，無任何的莢膜與鞭毛。這種細菌可以直接通過0.10～0.40 nm的濾菌膜，在pH為7.40的生理性鈣磷濃度中可以直接形成一種羥石灰碳酸鹽結晶，這種羥石灰碳酸鹽結晶能夠受此作用的影響而產生非常堅硬的礦化外殼，并且直接在菌體周圍所覆蓋，這樣會使很多高溫強酸的微生物依然可以在這種極為艱難的環境下正常生存，正常進行繁殖[6-8]。納米細菌的生長非常緩慢，倍增的時間一般在1～3 d，無任何典型的形態學特征[9-10]。納米細菌在非常多疾病的發生和發展過程中都起著至關重要的作用[11]。納米細菌在關節炎、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病，甚至在人體組織內病理性鈣化和硬化疾病也具有一定的作用[12-14]。納米細菌在生理性鈣磷濃度中就能在其周圍形成一種礦化外殼，這種外殼會在一定程度上引起結石、鈣化或在組織器官內同時可產生脂多糖成分，這種成分參與了整個炎癥過程，為各種疾病的發生和發展提供更多的機會[15]。肝病是我國臨床上最常見的一種疾病，主要有急性肝炎、慢性肝炎以及肝硬化等，這些病癥都直接影響患者的身體健康以及生活質量。肝病的發展與納米細菌相關[16-17]。

此次研究發現，肝病患者納米細菌的總感染率顯著高于健康人；通過ELASA法檢測，有90例患者呈現陽性，60例呈現陰性；通過PCR技術檢測，有110例患者呈現陽性，40例呈現陰性，兩種方法的陽性檢出率無明顯差異。由此可見，聚合酶鏈反應法是一種可靠、安全的方法，應用在納米細菌的檢測中具有顯著的效果。納米細菌感染機體組織和細胞，有效分泌鈣化脂多糖生物膜，在感染的過程中還會出現一定的炎性因子，會威脅到患者的生命安全[18]。慢性乙型肝炎、肝硬化肝癌的發生機制在當前臨床研究中尚未明確。此次研究充分證實了慢性肝病、肝癌患者血清、組織中都存在納米細菌感染，且感染率高于健康人。如果可以有效確立納米細菌的病因學理論，就可以為相關并的預防提供有效、新型的檢測方法[19-21]。

綜上所述，對于肝病患者，采用聚合酶鏈反應法開展檢測工作其效果非常顯著，可以證明部分慢性肝病、組織中存有納米細菌感染，證明肝病患者納米細菌的總感染率顯著高于健康人，納米細菌感染與肝病發展的過程中有著一定的聯系。