酒精中毒大鼠腦血管及細胞損傷相關超微結構改變

趙 麗， 關繼奎， 陳嘉峰

隨著食入性酒精的大量攝入，酒精中毒(alcoholism)引發腦血管病變及腦組織損傷的病例在我國日漸增多。雖然目前國內外對酒精中毒導致腦血管病變的機制已經有了深入研究，但是對于腦血管及腦組織的超微結構的損傷報道尚少。本實驗制備了大鼠酒精中毒的動物模型，并通過透射電子顯微鏡觀察酒精中毒組大鼠與對照組大鼠腦血管及腦組織超微結構的改變，并對兩者之間的聯系進行討論。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠38只，體重200～300 g，由長春高新醫學動物實驗研究中心提供。同一批大鼠隨機分為酒精中毒組22只與對照組16只，每籠5～6只，分籠飼養，按晝夜時程在室溫及穩定濕度條件下以平衡飼料喂養，自然飲水。

1.1.2 主要試劑 食用酒精；無水乙醇(上海建原化工有限公司)；甲醛(山西開原化工廠)；蒸餾水；生理鹽水。

1.2 方法 酒精中毒大鼠動物模型制備：Wistar雄性大鼠正常喂養1 w后開始造模。酒精中毒組：每天每只大鼠按8 ml/kg以50%食用酒精分兩次進行灌胃，其間間隔6 h，2 w后改為每天每只大鼠按10 ml/kg用50%食用酒精分兩次進行灌胃，1 w后再改為每天每只大鼠 按12 ml/kg用50%食用酒精分兩次進行灌胃，其間間隔均為6 h，共灌胃4 w。對照組：同時用等量生理鹽水進行灌胃。兩組大鼠均灌胃4 w后應用4 ℃預冷的4%多聚甲醛及2%戊二醛按照1∶1體積配制的固定液經升主動脈灌注固定后取出腦組織，切成1 mm3的組織塊置于3%的戊二醛中固定，逐級酒精脫水，Epon812定向包埋，超薄切片為700A厚度，經檸檬酸鉛及醋酸鈾染色，切片通過透射電子顯微鏡觀察腦部超微結構改變并探討腦功能損失相關機制。

2 結 果

2.1 一般情況 實驗組最終可用于實驗的大鼠15只，灌胃4 w后存活12只，死亡率為20%。2 w后對照組大鼠能夠適應灌胃操作，體重正常增長。實驗組大鼠始終存在灌胃困難。并逐漸出現反應遲鈍、毛發干枯、脫落、倦怠、進食量減少、營養不良、消瘦等情況。灌胃2 w后約1/4的大鼠出現神經系統損傷表現：偏側肢體癱瘓及病變側霍納氏征。3 w后兩組大鼠的體重(g)差異有統計學意義(P<0.05)，4 w后兩組大鼠體重差異有顯著統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 兩組大鼠存活及體重(g)比較

2.2 超微結構改變 對照組大鼠小腦毛細血管內皮細胞為單層扁平上皮細胞，細胞表面有微絨毛突起。細胞核內周邊處為染色較深的異染色質，常染色質(chromatin)位于細胞核的中央部分，染色較淺，分布均勻。核仁(nucleolus)明顯。細胞質內細胞器豐富(見圖1)。造模組大鼠小腦毛細血管內皮細胞同樣為單層扁平上皮細胞，但細胞形狀不規則，細胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質分布不均勻，異染色質增多，并可見丘狀突起。核仁不明顯。細胞質(cytoplasm)內細胞器明顯減少(見圖2)。對照組大鼠小腦毛細血管內皮細胞的細胞核為橢圓形，核膜完整，異染色質染色較深，位于周邊，常染色質染色較淺，分布均勻，位于中央。并可見多個核孔。核仁明顯，形狀規則(見圖3)。造模組大鼠小腦毛細血管內皮細胞的細胞核形狀不規則，核膜斷裂，染色質分布不均勻，見不到核孔，核仁不明顯，形狀不規則(見圖4)。對照組大鼠海馬(hippocampus)內的髓鞘結構(brain myelination)為由多層質膜構成的板層樣結構。其切面呈同心圓狀(見圖5)。造模組大鼠海馬內可見輕度脫髓鞘改變，多層質膜構成的板層樣髓鞘有輕度脫落及破壞(見圖6)。對照組大鼠額葉內線粒體(mitochondrion)為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍而成，由內膜折疊形成的嵴為彎曲的管狀，嵴平行排列，數目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(ribosome)(見圖7)。造模組大鼠額葉內的線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現斷裂，數目減少，排列不規則。嵴上附著的核糖體有脫落(見圖8)。對照組大鼠額葉內可見大量的管狀粗面內質網(rough surfaced endoplasmic reticulum，RER)，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個散在或者以多聚核糖體的形式存在(見圖9)。造模組大鼠額葉內管狀粗面內質網斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數量明顯減少，分布不規則，管膜外表面附有的核糖體脫失(見圖10)。

圖1 對照組大鼠小腦毛細血管內皮細胞表面有微絨毛突起。細胞核周邊為異染色質，常染色質位于中央，分布均勻。核仁明顯。細胞質內細胞器豐富(×12000)。圖2 實驗組大鼠小腦毛細血管內皮細胞形狀不規則，細胞表面的微絨毛突起明顯減少，常染色質分布不均勻，異染色質增多，可見丘狀突起。核仁不明顯。細胞質內細胞器明顯減少(×12000)。圖3 對照組大鼠小腦毛細血管內皮細胞的細胞核為橢圓形，核膜完整，并可見多個核孔。核仁明顯，形狀規則(×20000)。圖4 實驗組大鼠小腦毛細血管內皮細胞的細胞核形狀不規則，核膜斷裂，染色質分布不均勻，見不到核孔，核仁不明顯，形狀不規則(×20000)。圖5 對照組大鼠海馬內髓鞘為多層質膜構成的板層樣結構。其切面呈同心圓狀(×40000)

圖6 實驗組大鼠海馬內可見輕度脫髓鞘改變，多層質膜構成的板層樣髓鞘有輕度的脫落及破壞(×40000)。圖7 對照組大鼠額葉內線粒體為扁橢圓形，由兩層單位膜包圍，內膜折疊形成嵴，平行排列，數目較多，嵴的切面為小泡狀或者短管狀。嵴上附有核糖體(×80000)。圖8 實驗組大鼠額葉內線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴斷裂，數目減少，排列不規則。嵴上附著的核糖體有脫落(×80000)。圖9 對照組大鼠額葉內可見大量管狀粗面內質網，彼此緊密平行排列，管末端膨大成池。管膜外表面附有核糖體，核糖體為單個散在或者以多聚核糖體的形式存在(×50000)。圖10 實驗組大鼠額葉內管狀粗面內質網斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數量明顯減少，分布不規則，管膜外表面附有的核糖體脫失(×50000)

3 討 論

慢性酒精中毒可引起體內生物酶活性改變，導致基本新陳代謝異常，同時還引起大量細胞毒性反應[1]。研究表明酒精中毒會引起胚胎發育期的浦肯野細胞和其他神經細胞變性，引起神經軸索變性，從而導致神經細胞凋亡[2]。大腦海馬體主要負責長、短時間記憶、存儲轉換和定向等功能，是幫助人類處理長期學習與記憶聲光、味覺等事件的主要區域。從1950年起，科學家就已經注意到大腦海馬區與記憶間的關系，海馬體在大腦中幫助人體記憶分析，記憶篩選，是人體的記憶系統，發揮所謂的“敘述性記憶”功能。海馬神經元的退變是導致學習記憶功能減退的直接原因[3]。我們在酒精中毒大鼠的海馬區發現由多層質膜構成的板層樣髓鞘破壞了應有的同心圓結構，出現輕度脫落及破壞，是造成早期大腦認知功能障礙的原因之一；Porter、Claude和Fullam等人于1945年發現，他們在觀察培養的小鼠成纖維細胞時，發現細胞質內部具有網狀結構，建議叫做內質網(endoplasmicreticulum，ER)。分為粗面內質網及光面內質網兩類。細胞質中內質網的發達程度與其生命活動的旺盛程度呈正相關，凡蛋白質合成旺盛的細胞，粗面內質網會更發達。粗面內質網含量的高低也常反映腫瘤細胞的分化程度。在神經細胞中，粗面內質網與記憶有關。慢性酒精中毒可以使蛋白質轉運過程中未折疊或錯誤折疊的蛋白質存留在內質網或細胞質中，從而使內質網分子伴侶基因表達激活，引發內質網應激反應(endoplasmic reticulum stress response,UPR)，從而損傷內質網功能[4]。UPR通過降低蛋白質合成在有限程度上減輕蛋白質折疊給內質網帶來的負荷，但是該調解有限，蛋白質過度堆積和鈣穩態進一步失衡將導致細胞無法修復，乃至凋亡[5]；粗面內質網表面附著核糖體。Palade[6]于1955年在哺乳類與禽類動物細胞中首次發現，他將這種新細胞器描述為密集的微粒或顆粒。核糖體是一種核糖核蛋白顆粒，主要由RNA(rRNA)和蛋白質構成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈。當細胞受損時，粗面內質網上的核糖體脫落于胞漿內，蛋白質合成下降或消失。損傷恢復后其蛋白質合成功能也隨之恢復。本實驗已經能夠證實酒精中毒大鼠額葉內管狀粗面內質網斷裂，長度減短，彼此間隔增寬，數量明顯減少，分布不規則，管膜外表面附有的核糖體脫失，導致相關記憶性蛋白質合成下降，也是造成認知障礙的機制之一。但酒精中毒導致認知障礙的產生部位及時間順序、干預措施需要進一步探索；據Rizzuto等[7]研究，內質網與線粒體之間存在很密切的關聯，二者通過膜交換鈣離子、脂質、糖化蛋白等物質。內質網穩態破壞會導致Ca2+攝取和轉運障礙從而影響線粒體功能[8,9]。慢性酒精中毒造成機體游離自由基產生增多損傷神經細胞功能，同時使線粒體中電子傳遞鏈活性抑制，使三磷酸腺苷(ATP)產生減少及細胞損傷[10]。

本實驗已經明確觀察到酒精中毒后大鼠大腦額葉皮質細胞線粒體明顯腫脹，近似圓形，兩層單位膜顯示不清晰，嵴出現斷裂，數目減少，排列不規則。嵴上附著的核糖體有脫落。此種改變可能與UPR及ATP減少有關；酒精中毒后小腦血管的改變是導致共濟失調及運動障礙的基礎。小腦血管單層扁平上皮細胞的損傷直接導致小腦血液供應障礙，我們認為是后續運動功能及共濟調節障礙的病理基礎之一。這種酒精中毒導致的小腦血管細胞超微結構的損傷是否能完全修復、是否存在修復的閾值，需要我們后續研究進一步探索。