進展性腦梗死患者外周血中自噬改變的研究

張 瑜， 李 捷， 高 元， 上官穩

急性缺血性腦卒中是目前被全世界廣泛關注的疾病之一，其中約29%～37%的腦梗死患者[1]，在發病后其神經功能缺損癥狀逐漸進展或呈階梯式加重，臨床上稱作“進展性腦梗死(progressive cerebral infarction，PCI)”[2]。

目前導致腦梗死進展加重的具體病理機制尚未完全闡明，除興奮性氨基酸的毒性作用、線粒體功能障礙、氧化應激、炎性損傷外[3,4]，國內外多項研究表明[5,10]，細胞自噬也參與了腦缺血損傷的發生、發展過程。本文通過對PCI患者早期外周血中自噬改變的探討，旨在為PCI的治療提供新的干預靶點。

1 資料和方法

1.1 研究對象 連續收集2018年10月-2020年10月在河南科技大學第二附屬醫院神經內科住院治療的急性腦梗死患者123例，納入標準：(1)首次發病且于24 h內入院，并符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》所制定的診斷標準[6]。排除標準：(1)入院后行靜脈溶栓或橋接治療；(2)合并急性心肌梗死、嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤、血液系統及免疫系統疾病；(3)入院前4 w存在嚴重感染、骨折外傷、重大手術及服用免疫抑制劑。進展性腦梗死的診斷標準：發病48 h內神經功能缺損癥狀逐漸進展或呈階梯式加重(NIHSS評分增加≥2分)[7]。符合進展性腦梗死診斷標準的納入PCI組(n=32)；符合急性腦梗死納入標準但不符合進展性腦梗死診斷的納入NPCI組(n=91)。其中PCI組男18例，女14例，平均(66.43±13.73)歲；NPCI組男52例，女39例，平均(65.49±11.33)歲。選取的對照組(n=37)為本院體檢中心同時間段內的健康體檢者，其中男21例，女16例，平均(63.74±12.94)歲。3組在性別、年齡上差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)、TRIzol試劑(Invitrogen公司)、反轉錄試劑盒(艾德來)；2×SYBR?Green 預混液(中國 DF)、analytikjena-Qtower2.2 型熒光定量PCR 儀(德國)、SCILOGEX D3024R離心機(美國)、普通 PCR儀analytikjena-Easycycler(德國)，人Beclin1酶聯免疫檢測試劑盒、人LC3-Ⅱ酶聯免疫檢測試劑盒、人P62酶聯免疫檢測試劑盒均購自上海商紅(SRB)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基線資料 記錄PCI組和NPCI組的一般臨床資料，主要包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、吸煙、飲酒等，并采用美國國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評估患者入院時的神經功能缺損程度，記為基線NIHSS評分。

1.3.2 樣本收集與處理 用EDTA抗凝管和普通血清管分別抽取PCI組和NPCI組入組后次日清晨的空腹肘靜脈外周血各8 ml左右，分別用于提取人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)及血清。同期健康對照組的血液樣本于體檢當日采集。(1)PBMC分離、RNA提取及cDNA合成：按差速密度梯度法分離PBMC后，應用TRIzol試劑按說明書提取總RNA。所提取RNA溶于DEPC處理的去離子水中，用紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度，按反轉錄試劑盒說明操作，反轉錄成cDNA。(2)血清提取：將外周血以3000 r/min，離心10 min，提取上層血清后分裝到無菌凍存管中，于-80 ℃冰箱凍存待檢。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測PBMC的Beclin1、LC3Ⅱ、P62 mRNA水平 取上述反轉錄合成的cDNA進行PCR擴增，總反應體積為10 μl。擴增程序：95℃預變性3 min；(95 ℃反應10 s，60 ℃反應30 s，72 ℃反應20 s)×40個循環。以GAPDH為內參，各自噬因子及內參基因的引物序列如下：Beclin1 上游5’-GTCCAACAACAGCACCAT-3’，下游5’-ACGGTCCAGGATCTTGAA-3’；LC3Ⅱ 上游5’-ATGTCAACATGAGCGAGTT-3’，下游5’-GTTCACCAGCAGGAAGAA-3’；P62 上游5’-AGAGACAAAGCCAAGGAG-3’，下游5’-AAGAGCATAAGCCTCACAT-3’；GAPDH上游5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。采用2-ΔΔCt法計算各目標基因mRNA的表達水平。每組設置3個復孔，實驗均重復3次。

1.3.4 ELISA法檢測Beclin1、LC3Ⅱ、P62蛋白水平 按照各試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 PCI組與NPCI組一般臨床資料比較 兩組研究對象在年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、吸煙、飲酒、基線NIHSS評分等危險因素方面比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)(見表1)。

表1 PCI組和NPCI組基線臨床資料的比較

2.2 自噬相關基因相對表達量的比較 PCI組較NPCI組和對照組Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相對表達量增高、P62 mRNA的相對表達量降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。NPCI組較對照組Beclin1和LC3Ⅱ mRNA的相對表達量增高(P<0.05)、P62 mRNA的相對表達量之間無差異(P>0.05)(見表2)。

表2 3組研究對象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62 mRNA相對表達量的比較

2.3 自噬相關蛋白表達量的比較 PCI組較NPCI組和對照組Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表達量增高、P62蛋白的表達量降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。NPCI組較對照組Beclin1和LC3Ⅱ蛋白的表達量增高(P<0.05)、P62蛋白的表達量之間差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 3組研究對象Beclin1、LC3Ⅱ 及P62蛋白表達量的比較

3 討 論

近年來，大量的研究證明[8～10]自噬參與了腦缺血及缺血-再灌注損傷的病理過程，并且影響神經細胞的生存和死亡。PCI作為缺血性腦卒中的特殊類型，具有較高的致殘率和死亡率，臨床預后欠佳，但關于PCI患者外周血中自噬水平的改變目前鮮少見諸報道，故深入研究其自噬機制具有重要的理論價值和現實意義。

細胞自噬是一種細胞通過自噬溶酶體降解細胞內容物的過程，自噬信號通路涉及多種因子[11～13]，其中Beclin1是自噬的直接執行者，也是介導其他自噬蛋白定位于自噬小體的關鍵因子。LC3Ⅱ 反應了自噬的激活，LC3-I轉化為LC3Ⅱ 的檢測可作為自噬囊泡形成的證據。P62與LC3直接結合，并被自噬所降解。因此Beclin1、LC3Ⅱ、p62 參與了調控自噬體的形成、成熟和降解的過程，故三者的表達量能夠反映細胞的自噬程度。

本實驗通過qRT-PCR和ELISA的方法分別檢測自噬因子的mRNA和蛋白表達量，證實健康人外周血中Beclin1、LC3Ⅱ、p62有一定程度表達，存在自噬活性。同時NPCI組較對照組beclin1、LC3Ⅱ mRNA和蛋白的表達量增高，說明腦組織發生急性缺血損傷后，自噬途徑被激活。PCI組較NPCI組的自噬水平更高，表現為beclin1、LC3Ⅱ 的mRNA和蛋白的表達量均增加、P62 mRNA和蛋白的表達量均降低。綜合以上結果說明，適度的自噬可幫助細胞恢復內環境的穩態，促進損傷神經細胞的修復，但過度自噬可能誘導細胞死亡并加重缺血性損傷[14]。自噬的過度激活可能是導致PCI患者早期神經功能惡化和臨床癥狀加重的發病機制之一，與Jiang[15]等的觀點一致。

目前自噬在腦缺血損傷中的作用仍存在爭議。Shu、Zhang等[16～18]發現，在腦組織缺血損傷的過程中通過施加藥物或者治療抑制自噬水平后，可以減輕神經功能缺損癥狀。Hwang、Wu等[19,20]的研究則顯示應用自噬激動劑雷帕霉素提高自噬水平可以減少細胞凋亡和壞死，從而改善預后。以上研究結果不同，可能與不同的動物或細胞模型、不同的缺血時間點、不同的給藥方法或預處理時間等多種因素有關。

綜上所述，通過本研究證實PCI患者早期外周血中存在自噬的過度激活，但是否調控自噬能改善PCI患者的預后，需要進一步的基礎和臨床試驗加以驗證。