MFGE8在缺血性腦損傷中表達及對巨噬細胞極化的調控作用

柳 正, 王朝暉, 周春亭,2

缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)是由于遠端動脈狹窄、腦血流下降及永久性腦梗死引發的突發神經功能缺損疾病[1～4]。研究報道，小膠質細胞/巨噬細胞的不同表型極化與IBI的病理性發生發展密切相關[5]。在缺血性腦卒中和IBI后，腦內皮質和紋狀體中出現動態小膠質細胞的M1極化[6]。引起包括高表達促炎細胞因子，如TNF-α和誘導型一氧化氮合酶等；相反，M2亞型的小膠質細胞/巨噬細胞在促進腦修復過程中起重要作用，包括神經發生、血管生成、軸突重塑及髓鞘再生等[5,7]。因此，闡明M1向M2亞型過渡的機制可能為腦卒中提供新的和有針對性的治療方法。

乳脂球-表皮生長因子VIII(Milk Fat Globule-EGF Factor 8，MFGE8)是一種分泌型糖蛋白，具有調節凋亡性細胞吞噬和抗炎作用等[8～10]。MFGE8在腦缺血和腦外傷中已顯示出有益作用[11,12]。MFGE8具有調控腫瘤相關巨噬細胞M2型巨噬細胞極化的作用[13]。因此，本研究擬分析:(1)MFGE8蛋白在IBI和MCAO模型大鼠外周血中的表達變化；(2)持續激活Mfge8的N2a細胞上清對BV-2小膠質細胞系極化比例的影響；(3)持續激活Mfge8的N2a細胞上清對BV-2小膠質細胞系PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響。進而，為揭示IBI患者低表達MFG-E8和M1型巨噬細胞極化之間聯系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只無特定病原體級別的健康雄性Sprague-Dawley大鼠(年齡：2～3 個月)購自北京維塔爾河實驗動物技術有限公司(中國北京)。大鼠被關在8個獨立的籠子里，每個籠子里有2只大鼠，自由進食和飲水。所有大鼠均在(25±2)℃的室溫下喂養，12 h光照/黑暗循環，持續7 d。

1.2 主要試劑 小鼠N2a神經元細胞系和小鼠BV-2小膠質細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。胎牛血清(FBS)和Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)購自武漢塞維爾生物科技有限公司。Mfge8持續激活(Continual activation，CA)慢病毒質粒購自武漢奧克鼎盛生物科技有限公司。人MFGE8酶聯免疫吸附(ELISA，D711255)試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，大鼠MFGE8酶聯免疫吸附(ELISA，ABIN6957839)試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，小鼠MFGE8酶聯免疫吸附(ELISA，SEB286Mu)試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。抗大鼠Fc-Blocker、CD45-APC、F4/80-FITC、iNOS-PE和Arginase 1-PE-Cy7抗體購自北京達科為生物科技有限公司。Mfge8(Protein Tech)、NeuN(Protein Tech)、F4/80(Protein Tech)、αv/β3-integrin(Protein Tech)、Fak(Protein Tech)、p-P65(Affinity)、P65(Affinity)、p-Erk1/2(Affinity)、Erk1/2(Protein Tech)、Jnk1/2(Protein Tech)、P38(Protein Tech)、P110α(Service bio)、P110β(Service bio)、p-P85(Affinity)、P85、p-AKT(Ser473)(Affinity)、p-AKT(Thr308)(Affinity)、p-mTOR(Ser2481)(Affinity)、p-mTOR(Ser2488)(Affinity)、mTOR(Protein Tech)和β-actin(Protein Tech)。FITC、CoraLite594和HRP兔和鼠二抗(Protein Tech)。其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 一般資料 征集2019年2月-2021年1月本院收治的24例缺血性腦卒中患者和40名正常對照人群。正常對照人群：年齡(66.51±4.42)年，男20例，女20例。缺血性腦卒中組：年齡(69.52±7.56)年。男14例，女12例，兩組一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。納入標準：(1)CT檢查明確診斷為缺血性腦損傷；(2)未進行相關治療。排除標準：(1)缺氧性腦損傷患者和外傷性腦損傷患者；(2)臨床資料不全者;(3)CT檢查以除外腦出血、硬膜下或硬膜外血腫、瘤卒中等。本文研究經本院倫理委員會審核批準，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.3.2 IBI大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型 依據文獻報道[1]，大鼠接受大腦中動脈閉塞(MCAO)。大鼠在手術前禁食12 h，但仍可飲水。術中腹腔注射2%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。之后，切開頸部的右前部。暴露右側頸動脈三角后，分離雙側頸總動脈(CCA)、左頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)的起始端。然后用動脈夾夾住CCA近端和 ECA 遠端，使用眼科剪刀將ECA分叉到距CCA10 mm 處。將5號動脈導管置入CCA端，松開CCA近端動脈夾，用20 ml注射器采集動脈血10 ml。接下來，夾住CCA近端，移除動脈導管，然后打開ECA。將一根 20 mm尼龍線沿血流插入ECA，縫合切口。缺血2 h后，將尼龍線拉回CCA(恢復大腦中動脈供血)。手術后使用加熱墊將動物環境溫度保持在37 ℃±0.5 ℃。手術結束后，將動物放入帶有干凈墊子的飼養箱中，并提供自由取食和飲水。空白對照組采用類似操作的假手術(Sham)。

1.3.3 免疫熒光檢測 大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠腦組織切片采用常規脫水、石蠟包埋切片。檸檬酸緩沖液修復后，加入Mfge8(1∶200)、NeuN(1∶500)或F4/80(1∶200)抗體，4 ℃孵育18 h，TBST漂洗3次(5 min/次)后二抗(1∶250)室溫孵育2 h。TBST漂洗3次(5 min/次)后采用明美熒光顯微鏡拍照。

1.3.4 細胞培養 小鼠N2a神經元細胞系和小鼠BV-2小膠質細胞系常規培養與含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中。以5×104個細胞/孔的密度接種細胞于12孔板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。隨后，小鼠N2a神經元細胞系轉染Mfge8持續激活(Continual activation，CA)慢病毒質粒，收集細胞和培養上清，小鼠N2a神經元細胞系培養上清加入至小鼠BV-2小膠質細胞系中繼續培養24 h。

1.3.5 流式細胞術檢測巨噬細胞極化 腦組織加入含2%FBS的PBS，并采用注射器頭部于冰上碾碎。采用70 μm濾網過濾后，染色。培養細胞采用EDTA消化后，400 g 室溫離心5 min收集。細胞重懸于PBS中，加入Fc-Blocker室溫孵育30 min,400 g 室溫離心5 min。細胞重懸于PBS中，加入CD45-APC、F4/80-FITC染色室溫孵育30 min，400 g 室溫離心5 min。細胞重懸于PBS中，加入4%多聚甲醛固定 15 min，1% TritonX-100破膜 30 min，加入iNOS-PE和Arginase 1-PE-Cy7抗體室溫孵育30 min。400 g 室溫離心5 min。細胞重懸于500 μl PBS中。漂洗兩次后，細胞重懸于500 μl PBS中上機檢測。

1.3.6 酶聯免疫吸附(ELISA)檢測MFGE8蛋白表達 根據酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒使用說明，以標準曲線法檢測缺血性腦損傷(IBI)、大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠和小鼠N2a神經元細胞系培養上清中MFGE8蛋白表達。

1.3.7 免疫印跡檢測MFGE8蛋白表達 將處理的小鼠N2a神經元細胞系和小鼠BV-2小膠質細胞系加入100 μl的RIPA裂解液，冰上孵育30 min，超聲破碎 10 s。14000 g 4℃離心20 min。上清通過BCA法檢測蛋白濃度后，加入5X 上樣緩沖液于95 ℃變形5 min。以50 μg蛋白上樣量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，Turbo干轉15 min于0.22 μm的聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白溶液封閉1 h，孵育一抗，4 ℃孵育18 h，TBST漂洗3次(5 min/次)后二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次(5 min/次)后采用ECL顯影液于Bio-Rad 凝膠成像系統顯影，采用Image 2X軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1 MFGE8蛋白在IBI和MCAO模型大鼠外周血中的表達 IBI外周血中MFGE8的相對含量明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=2.051，P=0.0446)(見圖1A)；MCAO模型大鼠腦梗死面積(見圖1B、C)、神經功能缺損評分(mNSS)(見圖1D)和外周血中Mfge8的相對含量明顯低于假手術組(Sham)，差異有統計學意義(t=2.223，P=0.0259)(見圖1E)。

圖1 缺血腦損傷患者和MCAO模型大鼠外周血中MFGE8蛋白表達。A:ELISA法檢測缺血腦損傷(IBI)患者外周血中MFGE8蛋白表達；B:MCAO模型大鼠腦組織梗死代表圖；C：MCAO模型大鼠梗死面積統計分析圖；D:MCAO模型大鼠神經功能缺損評分(mNSS)統計分析圖；E:ELISA法檢測缺血腦損傷患者外周血中MFGE8含量(*P<0.05,**P<0.01)

2.2 Mfge8蛋白在MCAO模型大鼠腦組織中的定位表達 Mfge8蛋白與神經元細胞標志(NeuN)高度共定位表達(見圖2A)；Mfge8蛋白與巨噬細胞標志(F4/80)并不共定位表達(見圖2B)。

圖2 MCAO模型大鼠腦組織Mfge8蛋白表達檢測。A:免疫熒光法檢測Mfge8和NeuN定位表達代表圖；B:免疫熒光法檢測Mfge8和F4/80定位表達代表圖

2.3 MCAO模型大鼠腦組織巨噬細胞極化比例檢測 MCAO模型大鼠腦組織中M1型巨噬細胞比例明顯高于Sham，差異有統計學意義(t=4.063，P=0.0004)(見圖3A～C)；M2型巨噬細胞比例明顯低于Sham，差異有統計學意義(t=5.964，P<0.0001)(見圖3A、B、D)。

圖3 缺血腦損傷患者和MCAO模型大鼠腦組織巨噬細胞極化比例變化。A:流式細胞術檢測巨噬細胞極化設門策略；B:流式細胞術檢測MCAO模型大鼠腦組織巨噬細胞極化代表圖;C：流式細胞術檢測MCAO模型大鼠腦組織巨噬細胞極化統計圖(***P<0.0001)

2.4 持續激活Mfge8的N2a細胞上清對BV-2小膠質細胞系極化的影響 Mfge8蛋白在Mfge8CA組的N2a神經細胞系中的相對表達量和培養上清中的含量明顯高于WT組的N2a神經細胞系，差異有統計學意義(t=9.638，P<0.0001;t=4.484，P=0.0003)(見圖4A、B)。Mfge8CA 組N2a神經細胞系培養上清處理的BV-2小膠質細胞M1型巨噬細胞比例明顯低于WT，差異有統計學意義(t=2.405，P=0.0230)(見圖4C、D)；M2型巨噬細胞比例明顯高于野生組WT，差異有統計學意義(t=5.859，P<0.0001)(見圖4C、E)。

圖4 持續激活Mfge8對BV-2小膠質細胞極化的影響 A:免疫印跡法檢測持續激活Mfge8的N2a神經細胞Mfge8蛋白表達代表圖和統計圖；B:ELISA法檢測持續激活Mfge8的N2a神經細胞培養上清統計圖；C:流式細胞術檢測持續激活Mfge8的N2a神經細胞培養上清對BV-2小膠質細胞極化代表圖;D&E：流式細胞術檢測MCAO模型大鼠腦組織巨噬細胞極化的統計圖(*P<0.05,***P<0.0001)

2.5 持續激活Mfge8N2a細胞上清對BV-2小膠質細胞極化相關蛋白表達的影響 αv/β3-整合素和Fak在Mfge8CA 組BV-2小膠質細胞中的相對表達量明顯高于WT組，差異有統計學意義(t=2.405，P<0.0001；t=3.274,P<0.0113)(見圖5A、B)。p-P65蛋白在Mfge8CA 組BV-2小膠質細胞中的相對表達量明顯低于WT組，差異有統計學意義(t=6.013，P<0.0001)(見圖5A、D)。

圖5 持續激活Mfge8對BV-2小膠質細胞極化相關蛋白表達的影響。A:免疫印跡法檢測蛋白表達代表圖；B～E: 免疫印跡法檢測蛋白統計圖(*P<0.05,***P<0.0001)

2.6 持續激活Mfge8對BV-2小膠質細胞PI3K/AKT/mTOR信號蛋白表達的影響 P85、P85、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser2481)和p-mTOR(Ser2488)蛋白在Mfge8CA組BV-2小膠質細胞中的相對表達量明顯高于WT組，差異有統計學意義(**P<0.001,P<0.0001)(見圖6)。

圖6 持續激活Mfge8對BV-2小膠質細胞PI3K/AKT/mTOR信號蛋白表達的影響。A:免疫印跡法檢測蛋白表達代表圖；B～G:免疫印跡法檢測蛋白統計圖(**P<0.001,***P<0.0001)

3 討 論

缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)是一種復雜的病理變化，極易導致殘疾和癡呆[1]。越來越多的證據表明，IBI早期小膠質細胞M1型極化是導致神經性血管炎癥和腦血管重塑抑制的重要誘因[7,14]。促炎因子的釋放極易導致神經毒性和神經元損傷[15,16]。MFGE8在急性損傷和炎癥反應中發揮多種作用[8,9]。MFGE減少缺血再灌注損傷，減輕早期腦損傷中的細胞凋亡和炎癥[13,17]。然而，MFGE8在IBI中的表達及對小膠質細胞極化的調控作用尚未見報道。

本研究發現，缺血性腦卒中患者外周血中的Mfge8蛋白含量明顯降低。大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型外周血和腦組織中Mfge8蛋白含量明顯低于假手術組。同時，MCAO大鼠模型腦組織中巨噬細胞呈現M1型極化增強，M2型極化減弱。提示，MFG-E8下調與腦組織中巨噬細胞的促炎性M1型極化有關。這與早期報道的重組MFG-E8在體調節炎癥、氧化應激，尤其是腦缺血和神經退行性疾病中的細胞凋亡來提供神經保護一致[18]。其次，本研究證實，Mfge8主要來源與神經元細胞，且持續激活Mfge8的神經元細胞培養上清可體外促進M2小膠質細胞/巨噬細胞極化，抑制M1小膠質細胞/巨噬細胞極化。MFGE8可通過整合素β3/FAK/PI3K/AKT 信號通路減少大鼠腦外傷后細胞凋亡[18]，通過整合素β3/SOCS3/STAT3信號促進小膠質細胞表型轉化為 M2 來抑制神經元炎癥[18]。因此，本研究檢測Mfge8下游巨噬細胞極化相關蛋白表達。結果表明，神經元細胞來源的Mfge8可激活整合素β3/FAK/PI3K/AKT/mTOR信號促進M2小膠質細胞/巨噬細胞極化，并抑制Nf-κB炎性蛋白表達。因而，Mfge8是抑制IBI腦組織炎性反應的重要調控分子之一。并且，神經元細胞Mfge8分泌下調是IBI腦組織小膠質細胞/巨噬細胞極化異常的重要誘因。

綜上所述，IBI外周血中下調的MFGE8可能是腦組織中炎性增強的重要標志，且神經元細胞來源的MFGE8減少導致小膠質細胞/巨噬細胞M1型極化增強，誘發炎性反應并抑制抗炎反應，繼而可能損傷血管重塑等引起缺血損傷。MFGE8對小膠質細胞/巨噬細胞極化的調控作用與整合素β3/FAK/PI3K/AKT/mTOR信號相關。