甘蔗ScCRT1 基因克隆及其應答SCMV 侵染分子機制的研究

張 海 程光遠 楊宗桃 王 彤 劉淑嫻 商賀陽 趙 賀 徐景升

福建農林大學國家甘蔗工程技術研究中心 / 農業農村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室 / 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室, 福建福州 350002

鈣網蛋白(calreticulin, CRT)在真核生物中高度保守并廣泛表達[1-4], 主要定位于內質網(endoplasmic reticulum, ER)和胞間連絲(plasmodesmata, PD), CRT是內質網中主要的Ca2+結合蛋白, 具有分子伴侶功能[5-8]。Ca2+是細胞內重要的第二信使, 在細胞信號轉導中具有重要作用[5,9]。因此, CRT 參與調控Ca2+穩態、信號轉導、內質網質控(endoplasmic reticulum quality control, ERQC)、生長發育和免疫應答等多種生物學過程[2-4,10-12]。CRT 在哺乳動物中的研究較為深入, 該蛋白除了上述基本生物功能外, 還參與了癌癥等疾病的發生[13-14]。植物中CRT 的研究相對滯后[15], 研究表明CRT 廣泛應答生物和非生物脅迫,參與干旱、低溫、鹽脅迫、真菌、細菌、病毒的侵染等逆境脅迫反應[2,4,8,16-21]。

甘蔗(Saccharumspp. hybrid)是我國和世界上最重要的糖料作物和能源作物[22-24]。甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)屬于馬鈴薯Y 病毒科(Potyviridae) Y 病毒屬(Potyvirus), 是甘蔗花葉病的主要病原之一, 嚴重危害甘蔗生產[25-28]。SCMV為單鏈正義RNA 病毒, 長度約為10 kb, 編碼2 個多聚蛋白, 經自身編碼的蛋白酶裂解后形成11 個成熟的功能蛋白, 從N 端至C 端分別為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb 和CP蛋白[29-32]。其中, 6K2 蛋白參與病毒的復制、胞內與胞間移動, 在馬鈴薯Y 病毒屬病毒建立系統性侵染過程中起著至關重要的作用[33-37]。

本課題組在前期研究中, 以SCMV 編碼的6K2蛋白為誘餌, 從甘蔗品種ROC22 葉片cDNA 酵母文庫中篩選到了具有完整開放讀碼框(open reading frame, ORF)的CRT基因, 其長度為1281 bp。在本研究中, 我們進一步從Badila 葉片中克隆了該基因,命名為ScCRT1。本研究利用 RT-qPCR 分析了ScCRT1基因在甘蔗不同組織中的表達特異性以及應答 SCMV 侵染的表達情況; 利用酵母雙雜交(yeast 2 hybrid, Y2H)和雙分子互補(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技術驗證了ScCRT1 蛋白與SCMV-6K2 的互作關系; 利用瞬時表達試驗, 研究了ScCRT 的亞細胞定位。本研究為研究SCMV 侵染甘蔗的分子機制提供了實驗證據, 并為甘蔗抗花葉病育種提供了基礎數據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及處理方法

SCMV 病毒、甘蔗品種Badila 組培苗、本氏煙(Nicotiana benthamiana)苗由福建農林大學農業農村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室提供。2019 年11 月, 待組培苗長至15～25 cm、完全展開葉出現4～5 片時, 摩擦接種SCMV, 設置3 個重復,每個重復5 株, 對照植株使用磷酸緩沖液(pH 7.0)摩擦接種, 使用SCMV-CP基因特異引物(表1)檢測接種是否成功。分別在接種后0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、1 d、2 d、3 d、4 d 取樣, 研究目的基因應答SCMV 侵染的表達模式。在隔離網室內隨機選取9株處于伸長期且長勢一致健康的Badila植株, 分成3 組, 每組3 株。取其白色嫩根、心葉(未展開的葉)、正一葉(甘蔗最高可見肥厚帶的第一葉)、正四葉、第四節間、第八節間, 用于研究目的基因的組織表達特性。樣品采集后用液氮速凍, 置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

使用TRIzol (Invotrigen, USA)試劑, 按照說明書要求提取樣品總RNA, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量。使用Nanodrop (Thermo Scientific,USA)測定RNA 的濃度, 按照Prime Script RT Reagent Kit 使用說明書, 將RNA 反轉錄成cDNA。

1.3 ScCRT1 基因的克隆及生物信息學分析

以篩選酵母文庫獲得的CRT基因序列為參考,通過同源克隆的方法, 在起始密碼子和終止密碼子附近設計ScCRT1基因的特異擴增引物(表1)。以反轉錄獲得的cDNA 為模板, 使用PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa Bio, Japan)高保真酶, 參照Shinohara 等[38]的方法克隆ScCRT1基因, 并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

將測序獲得目的基因序列, 利用 NCBI 中的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)軟件分析開放閱讀框, 并獲取其氨基酸序列。利用ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)預測蛋白的一級結構、理化性質; 利用GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 和 TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別預測分析其二級結構、信號肽和跨膜特性; 用 Blastp 在線工具查找ScCRT1 的同源氨基酸序列, 使用DNAMAN 6.0 軟件多重比對同源氨基酸序列, 使用 ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法構建系統進化樹。

1.4 ScCRT1 的RT-qPCR 表達分析

根據ScCRT1基因的ORF 序列, 設計特異性實時熒光定量PCR 引物(表1), 以GAPDH基因和eEF-1α基因(表 1)作為內參基因[39]。按照 SYBR Green PCR Master Mix (Roche)說明書配制定量反應體系, 在熒光定量PCR 儀上完成定量PCR 擴增。每個樣品設置3 次技術重復, 以無菌水作對照, 擴增程序為50℃ 2 min, 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃1 min, 40 個循環。反應結束后, 采用2–ΔΔCt算法分析獲得的數據[40]。

1.5 ScCRT1 的亞細胞定位

參照Cheng 等[29]的方法, 利用Gateway 方法將ScCRT1構建到pEarlyGate101 載體中, 獲得ScCRT1亞細胞定位質粒 ScCRT1-YFP 并轉入農桿菌EHA105中。取健康的本氏煙植株, 參照Cheng 等[29]農桿菌侵染方法, 將帶有重組質粒的農桿菌注射入健康的本氏煙葉片。48 h 后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5II)下觀察本氏煙葉片表皮細胞中ScCRT1 蛋白的定位, YFP 的激發光波長為514 nm,捕獲波長為530～590 nm。

1.6 Y2H 驗證ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作

參照Zhang 等[34]的方法構建ScCRT1基因的誘餌載體pBT3-SET-ScCRT1, 利用Y2H 技術驗證其與pPR3-N-SCMV-6K2 的互作關系。pTSU2-APP 和pNubG-Fe65 組合作為陽性對照, pNubG-Fe65 和pPR3-N 組合作為陰性對照, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 組合為自激活驗證。

1.7 BiFC 驗證ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作

參照Cheng 等[29]的方法構建ScCRT1-YC 載體,利用BiFC 技術驗證其與YN-SCMV-6K2 的互作。YFP 的激發光波長為 514 nm, 捕獲波長為530～590 nm; 葉綠素自熒光的激發光波長為552 nm,采集波長為650～680 nm。

2 結果與分析

2.1 ScCRT1 基因的克隆與生物信息學分析

經PCR 擴增和測序, 本研究從Badila中克隆了1 條ORF 長度為1281 bp 的CRT基因, 該基因編碼426 個氨基酸。核苷酸序列比對表明, 該CRT 序列與高粱的CRT1 (Sorghum bicolor, XM_021451918.1)同源性高達96.49%, 將該基因命名為ScCRT1, 并提交GenBank, 登錄號為MT635395。ProtParam 分析表明, ScCRT1 的分子量為48.22 kD, 等電點為4.43;不穩定系數為 35.67, 為穩定蛋白; 脂溶指數為63.29, 總平均親水性是-1.023, 可能是親水性蛋白。GOR4 預測表明, ScCRT1 中無規則卷曲占比最高,達到60.09%; 其次是延伸鏈和α 螺旋, 占比分別為20.19%和19.72%; 無β-折疊結構?？缒そY構域預測結果表明, ScCRT1 具有1 個跨膜結構域, 其分布在13～35, 膜向性為 i→o。SignalP 5.0 分析表明,ScCRT1 蛋白含有信號肽, 且信號肽的剪切位點位于第31 和32 號氨基酸之間(圖1), 為分泌蛋白。

2.2 ScCRT1 的氨基酸序列同源性分析和系統進化樹分析

典型的CRT 蛋白含有3 個不同的結構和功能域:高度保守的球狀N-結構域, 其末端含有一個信號肽序列; P-結構域, 具有高親和力和低Ca2+結合能力;C-結構域表現出低親和力和高的Ca2+結合能力, 其末端包含有(K/H)DEL 內質網滯留信號[1-2]。在ScCRT1 氨基酸中發現具有上述典型的CRT 的3 個結構域組成, 殘基1～31 的疏水信號肽序列, 殘基32～216 的球形N-結構域, 殘基217～313 的富含脯氨酸P-結構域, 殘基314～426 的多酸性氨基酸C-結構域并含有內質網滯留信號HDEL 基序(圖1)。通過NCBI 網站的 Blastp 和 Phytozome 網站的 Proteome Blastp 搜索 ScCRT1 同源序列, 結果顯示,ScCRT1 蛋白與高粱(XP_021307591.1)、玉米(Zea mays, XP_008670080.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, XP_003563166.1)、谷子(Setaria italic,XP_004981159.1)、水稻(Oryza sativa, XP_01562 8738.1)和擬南芥(Arabidopsis thaliana, NP_176030.1)的CRT 蛋白相似度分別為96%、90%、92%、86%、78%、72%。對甘蔗及其他物種CRT 蛋白的氨基酸序列同源性分析表明, 在其N-結構域和P-結構域氨基酸序列高度保守, 信號肽序列和C-結構域氨基酸序列因物種的不同表現出明顯的差異(圖1)。

使用ClustalX 和MEGA 7.0 的ML (maximum likelihood, LG+G)法構建系統進化樹, 分析ScCRT1蛋白與其他物種CRT 蛋白的進化關系。結果表明,植物CRTs 蛋白主要分為2 種亞型: CRT1/CRT2 亞型和 CRT3 亞型。在擬南芥中 CRT 含有 AtCRT1(AT1G56340.2)、AtCRT2 (AT1G09210.1)和AtCRT3(AT1G08450.1) 3 種蛋白, 包括2 個蛋白亞型; 其中AtCRT1 與AtCRT2 相似性很高, 為CRT1/CRT2 亞型; AtCRT3 為CRT3 亞型, 該亞型與CRT1/CRT2 亞型存在著較大差異[41-42]?；谶M化樹分析, 我們克隆的ScCRT1 蛋白屬于CRT1/CRT2 亞型(圖2)。

單子葉植物甘蔗、高粱、柳枝稷(Panicum virgatum)、水稻、谷子、大麥(Hordeum vulgare)、二穗短柄草形成群I; 雙子葉植物煙草(Nicotiana tabacum)、葡萄(Vitis vinifera)、三葉楊(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa)、擬南芥形成群II (圖2)。在遺傳進化上, CRT 蛋白在單子葉植物和雙子葉植物之間存在明顯的分化。

2.3 ScCRT1 的亞細胞定位

在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草瞬時表達ScCRT1-YFP 融合蛋白的黃色熒光在細胞內的分布(圖3); ScCRT1-YFP 融合蛋白的黃色熒光信號為典型的內質網定位信號, 表明其主要定位于內質網。

2.4 ScCRT1 基因的組織特異性表達及應答SCMV 侵染的表達模式

基于RT-qPCR 技術, 以根中ScCRT1基因的表達量為參照基準, 采用 2–ΔΔCt法對甘蔗各組織ScCRT1基因表達量的分析結果(圖4)表明,ScCRT1基因的表達具有明顯的組織特異性, 在不同組織中的表達量差異較顯著, 其在心葉中的相對表達量最高, 根和正一葉次之, 第八節間中表達量最少。使用SCMV-CP基因特異引物(表1)檢測SCMV 接種的甘蔗, 選出擴增出目的片段的樣品, 進行ScCRT1基因應答SCMV 侵染的RT-qPCR 試驗。結果顯示SCMV的侵染對ScCRT1基因表達的影響顯著, 與對照相比,ScCRT1基因在侵染早期顯著上調, 在12 h 時表達量達到最大值, 然后下調表達, 但仍顯著高于對照(圖5)。

2.5 ScCRT1 與SCMV-6K2 的互作驗證

Y2H 試驗結果顯示, pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N 共轉酵母細胞NMY51和陰性對照在添加了5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的SD/-Leu/-Trp (DDO)培養基上生長, 但在添加了X-Gal 的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (QDO)培養基上不生長; pBT3-SET-ScCRT1 和pPR3-N-SCMV-6K2 共轉的酵母菌株NMY51和陽性對照在添加了X-Gal 的DDO 和QDO培養基上可以生長并呈現藍色(圖6)。表明pBT3-SET-ScCRT1 不具有自激活性; ScCRT1 與SCMV-6K2 蛋白在體外互作。

BiFC 試驗結果表明, 共注射的 YN-6K2 和ScCRT1-YC 在本氏煙葉片表皮細胞中產生黃色熒光信號(圖7), 說明ScCRT1 與SCMV-6K2 互作, 這與Y2H 試驗結果一致, 進一步表明 ScCRT1 與SCMV-6K2 互作。

3 討論

盡管病毒與寄主相融, 但是病毒侵染仍然會對寄主造成脅迫, 導致寄主在轉錄組水平對基因表達進行重新編程, 產生大量差異表達基因[43-46]。本課題組前期研究表明, 甘蔗花葉病另外1 個主要病原甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV,Poacevirus)侵染甘蔗品種FN40導致CRT基因表達上調[45]。本研究中,ScCRT1基因在SCMV侵染早期表達上調, 隨著時間加長逐漸下降, 但仍顯著高于對照。該結果與番木瓜PaCRT基因應答番木瓜環斑花葉病毒(Papaya ringspot virus, PRSV,Potyvirus)侵染的表達模式相似[21]。這些研究結果表明,CRT應答病毒侵染的分子機制可能相同, 這也與CRT 蛋白結構保守的特性相符。ScCRT1 主要定位在內質網中(圖3)。定位于內質網的CRT 參與了Ca2+穩態調控和內質網質控, 對于Ca2+依賴的信號傳導和新合成蛋白的正確折疊具有重要作用[9-10]。病毒侵染會造成內質網脅迫, 影響蛋白的正確折疊[45,47]。因此我們推測SCMV 侵染甘蔗也會造成內質網脅迫,干擾ScCRT1 作為分子伴侶協助蛋白折疊的功能,為此寄主上調ScCRT1表達以應答脅迫。

植物病毒與寄主長期協同進化[48]且結構簡單,必須與寄主因子互作才能建立系統性侵染[49]。本研究利用Y2H 和BiFC 試驗證明了SCMV-6K2 與ScCRT 的互作(圖6 和圖7), 互作位于內質網和細胞膜, 并且在細胞膜上出現點狀結構。我們推測細胞膜上的互作位點有可能位于胞間連絲, 這種互作可能在侵染早期阻礙SCMV 胞間移動。馬鈴薯Y 病毒的胞間移動是以6K2 誘導內質網形成的囊泡的形式進行的[36-37], SCMV-6K2 與ScCRT1 互作于胞間連絲,可能由于CRT 的Ca2+調節功能, 導致胞間連絲位置Ca2+濃度升高, 激活胼胝質合成酶Cals[50], 促進胼胝質合成積累, 進而減小胞間連絲的通透性。在煙草應答煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV,Tobamovirus)侵染的研究中, 也有類似研究報道。煙草的NtCRT 與TMV 的運動蛋白互作, 過表達NtCRT嚴重影響TMV 的胞間移動[8]。在非生物逆境鋁離子脅迫下, 小麥、煙草和苜蓿的CRT 上調表達, 與胼胝質共定位沉積于胞間連絲, 阻礙共質體運輸[51-52]。這些研究結果表明, CRT 參與調節胞間連絲的通透性。Badila極易感染SCMV, 在侵染后期, ScCRT1的表達量下調, 推測胞間連絲胼胝質積累下降, 通透性增加, 便于SCMV 胞間移動, 最終建立系統性侵染。

病毒在寄主體內建立系統性侵染是一個動態的生物學過程, 6K2 不但參與病毒的復制和胞間移動,還參與了自噬調節[53], 6K2 除了與病毒自身編碼蛋白CI、P3 互作[36,54-55]互作外, 還與很多寄主編碼蛋白互作[34]。而CRT 可能還與病毒編碼的其他蛋白互作, 比如番木瓜的 PaCRT 與番木瓜環斑病毒(Papaya ring spot virus, PRSV,Potyvirus)的HC-Pro互作[21]。因此, 闡明ScCRT1 在SCMV 侵染中的作用還需要進一步深入研究, 如Ca2+濃度的變化, 過表達或抑制ScCRT1的表達對SCMV 的復制和胞間移動的影響等。

4 結論

從甘蔗葉片中克隆到鈣網蛋白基因ScCRT1,GenBank 登錄號為MT635395。ScCRT1的ORF 長度為 1281 bp, 編碼 426 aa。亞細胞定位試驗表明,ScCRT1 蛋白定位于內質網; RT-qPCR 分析顯示, 該基因在心葉等幼嫩組織中表達量較高; 在SCMV 侵染條件下,ScCRT1基因的表達呈先上調后下調的表達模式; Y2H 與 BiFC 試驗表明, ScCRT1 與SCMV-6K2 蛋白互作。