一個新的水稻脆稈突變體bc17 的鑒定及基因定位

姜鴻瑞 葉亞峰 何 丹 任 艷 楊 陽 謝 建 程維民陶亮之 周利斌 吳躍進 劉斌美,*

1 中國科學院合肥物質科學研究院, 安徽合肥 230031; 2 中國科學技術大學, 安徽合肥 230026; 3 中國科學院近代物理研究所, 甘肅蘭州 730000

水稻莖稈的機械強度是重要的農藝性狀之一,直接影響著植株的抗倒伏能力。水稻脆性突變體是一類比較常見的突變體[1], 是研究細胞壁合成機制的重要材料。脆性突變一般是指植株莖稈機械強度下降, 通常表現為纖維素和半纖維素含量下降, 木質素含量升高[2], 在結構上表現為厚壁組織次生細胞壁變薄[3]。由于莖稈機械強度下降, 存在倒伏發生的隱患, 生產上一般認為是不利的性狀。然而脆性突變體秸稈脆嫩、纖維素含量下降, 有利于反芻動物采食, 消化更加容易, 具備成為糧飼兼用型水稻品種的應用潛力[4]。另外, 脆稈突變體的莖稈易粉碎降解, 對于秸稈生態還田有著很好的應用前景, 是一種重要的種質資源[5]。

從第一個水稻脆稈基因bc1[6]被發現以來, 對水稻脆性突變體的研究已有50 多年的歷史了。截止目前, 報道的水稻脆性突變體僅有20 多個, 大多數基因都是涉及細胞壁纖維素合成酶OsCesA (cellulose synthase)的變異, 其中以bc (brittle culm)命名的水稻脆性突變體有16 個(bc1～bc16), 相對研究的比較系統和深入, 并且對細胞壁合成調控的機制做了詳細解析[7-8]。細胞壁化學成分的變化、合成和轉運的阻滯以及厚壁組織結構發育異常等都可能引起水稻莖稈機械強度的改變[9-19]。近來發現水稻轉錄因子也參與細胞壁生物合成的過程[20-22]。水稻纖維素合酶基因是引起脆稈特性的關鍵基因, 其中最重要的是OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9, 可能形成一個纖維素合成復合體參與次生細胞壁的合成[12]。水稻脆稈基因bc7和bc11基因[13-14]是OsCesA4的等位變異;bc6和bc13基因[15-16]是OsCesA9的等位變異。bc10、bc14、bc15可能參與細胞壁的修飾, 其中bc10基因編碼一個定位在高爾基體的Ⅱ型內整合膜蛋白, 調節細胞壁纖維素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量[17],bc14基因編碼核苷酸糖轉運蛋白OsNST1, 定位于高爾基體, 轉運 UDPG, 可能為多糖生物合成提供底物[18]。bc15基因編碼一個膜相關的類幾丁質酶蛋白[19]。轉錄因子MYB 家族和NAC 家族參與到細胞壁的合成途徑, 比如NAC29/31-MYB61-CESA 通路調控細胞壁生物合成和組裝來影響次生細胞壁纖維素合成[20-22]。bc12基因編碼一個雙靶向的驅動蛋白4, 控制水稻細胞周期進程, 揭示細胞生長和細胞壁修飾存在潛在的聯系[23]。細胞壁的合成主要由不同類型的糖基轉移酶來完成, 而且目前被揭示功能的酶還很少, 明確具體生化特征的更少[8]。由于水稻細胞壁的生物合成過程非常復雜, 涉及的調控途徑類型多樣, 新基因的發掘和研究有助于完善細胞壁合成機制, 為水稻細胞壁定向改良育種奠定理論基礎。

本實驗以重離子輻照誘變粳稻品種武運粳7 號(Wuyunjing 7, wyj7)獲得的一個脆稈突變體為研究對象, 根據水稻脆稈突變基因命名規則和順序, 將其稱為bc17突變體(brittle culm 17), 分析bc17突變體的脆性性狀對農藝特征及機械強度的影響, 通過莖稈組織結構的解剖學及細胞壁成分的測定來分析脆性形成的生物學機制, 利用遺傳學及圖位克隆技術將bc17突變位點進行染色體定位, 通過生物信息學分析鑒定可能的候選基因, 為進一步分離目標基因奠定基礎, 同時為育種應用提供高效的篩選標記。

1 材料與方法

1.1 材料

脆稈突變體bc17、野生型武運粳7 號以及用于遺傳分析和基因定位的群體材料, 均種植于中國科學院合肥物質科學研究院水稻實驗基地(安徽合肥),種植方式為人工栽插, 常規田間管理。

1.2 農藝性狀分析

在田間隨機取10 株成熟期供試水稻材料, 考察其主要農藝特征和經濟性狀, 包括株高、穗長、分蘗數、每穗粒數、千粒重、結實率等。

1.3 細胞壁組分含量分析

根據Van Soest 等[24]方法測定細胞壁纖維素、半纖維素和木質素等主要組成組分含量。取成熟期的水稻材料, 將莖稈和葉片分開, 剪成適當的長度放入65℃烘箱中, 待完全烘干后取出, 用旋風磨分別將莖稈和葉片粉碎, 粉末裝入干凈的封口袋中以備后續實驗使用。重復3 次。

1.4 bc17 莖稈機械強度測定

1.4.1 莖稈拉伸力的測定 在成熟期從田間選取新鮮水稻材料, 將莖鞘分離后截取第2 節間莖稈夾持在萬能力學試驗機(LD23.502, 力試(上海)科學儀器有限公司)上, 在莖稈斷裂失去載荷后自動停止拉伸, 記錄數據。

1.4.2 莖稈抗折力的測定 在成熟期從田間選取新鮮水稻材料, 將莖鞘分離后截取第2 節間莖稈, 放置在等間距的支架上, 用數顯式拉壓力計(HP-50, 樂清市艾德堡儀器有限公司)從莖稈中部向下施壓使水稻莖稈折斷, 記錄施加力的峰值, 即為莖稈抗折力。

1.4.3 倒伏指數的計算 根據章忠貴等[25]的方法略有修改, 在成熟期采集新鮮樣品, 測量相應位置的長度和重量, 計算突變體和野生型第2 節間的彎曲力矩和倒伏指數。

彎曲力矩 = 節間基部至穗頂的長度(cm) × 該節間基部至穗頂的鮮重(g) × 0.001 × 9.8

倒伏指數 = (彎曲力矩/抗折力) × 100

倒伏指數越大, 則莖稈越易倒伏, 以倒伏指數200 為抗倒伏臨界值。

1.5 莖稈結構的電鏡觀察

取成熟期相同部位的脆稈突變體及其野生型莖稈切成2～4 mm 的小段, 投入含有2.5%戊二醛的PBS 緩沖液(4 mmol L–1sodium phosphate, pH 7.2;200 mmol L–1NaCl)中, 4℃固定48 h 后用1%鋨酸PBS (phosphate buffer saline)溶液固定。固定后的樣品經過PBS 緩沖液充分漂洗后, 順序用10%、20%、40%、60%和80%的乙醇梯度各處理30 min 脫水,再用100%乙醇處理2 次各30 min, 100%丙酮處理2次各 5 min。脫水后的材料依次用 London Resin White (Sigma, USA)樹脂與乙醇順序以1∶3、1∶1和3∶1 的比例混合進行置換和浸透, 最后換入純樹脂繼續浸透 48 h, 并于模塊中包埋, 60℃聚合24 h。樣品修塊后以80 nm 超薄切片, 放置于銅網上, 觀察前用醋酸鈾和檸檬酸鉛復染。樣品放置在透射電鏡上觀察[26]。

1.6 脆稈突變體bc17 的遺傳學分析

利用bc17突變體分別與粳稻品種(武運粳7 號和當粳8 號)和秈稻品種(特青、黃花占和9311)進行人工雜交, F1代經自交獲得F2代種子。在成熟期對F2代植株進行莖稈脆性鑒定, 統計野生型和突變表型個體的數目, 并用統計學方法計算分離比例和卡方檢驗。

1.7 bc17 基因的染色體定位

利用對bc17/9311 雜交構建的F2分離群體對bc17基因進行初定位, 采用BSA (bulked segregant analysis)法進行基因定位, 即混合分組分析, 也稱分離群體分組分析, 是一種通過在群體中挑選極端或代表性性狀的個體組成混池進行分析的方法。通過研究混池之間等位基因/分子標記頻率的差異, 將與性狀相關的位點在基因組上進行定位。選擇在水稻12 條染色體上均勻分布的408 個SSR (simple sequence repeat)標記進行親本多態性檢測, 利用篩選出的差異SSR 標記對親本、F1植株以及混合池(20個脆稈單株等量DNA 混合)進行PCR 擴增, 對電泳產物的統計分析。在精細定位階段, 根據網上公布的Nipponbare 和9311 序列, 并選擇定位區間中存在差異的序列進行引物設計與合成。用這些引物分別對bc17和9311 基因組DNA 進行PCR 擴增。PCR程序按常規方法進行。如果PCR 產物在bc17突變體和9311 間產生多態性, 就直接用作新的SSR 或者InDel (insertion and deletion)分子標記。

1.8 數據分析

采用Origin 2018 對本文實驗數據進行差異性分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 bc17 突變體的表型特征

通過對突變體bc17和野生型wyj7 在整個生育期中農藝特征的觀察發現: 該突變體從抽穗期開始,株高顯著低于野生型, 分蘗數明顯減少(圖1-A), 在拔節期時通過手工折斷實驗, 突變體bc17莖稈表現出韌性喪失, 能夠明顯折成兩截折斷且斷口清晰,而野生型莖稈則表現出韌性, 沒有斷口出現難以折斷(圖1-B)。突變體的葉片和野生型的類似, 均只能折出痕跡, 無明顯斷裂(圖1-C), 突變體的穗子比野生型變短, 穗粒數減少, 結實率顯著降低(圖1-D)。

2.2 bc17 突變體的農藝性狀分析

與野生型相比, 突變體bc17的株高、穗長以及結實率極顯著降低, 降低程度分別為 26.61%、27.51%以及18.54%, 每穗粒數降低了13.18%, 達到顯著水平, 而分蘗數和千粒重雖然降低, 但是差異不顯著(表1)。農藝性狀的變化表明,bc17脆稈性狀的突變對于植株的生長和發育也產生了較大的影響,可能存在一因多效。

2.3 細胞壁組分含量的分析

木質素(lignin)、纖維素(cellulose)、半纖維素(hemi-cellulose)以及灰分(主要成分是二氧化硅)是構成水稻細胞壁的主要成分。通過測定成熟期突變體bc17和野生型wyj7 莖稈、葉片的細胞壁組分含量, 結果表明, 突變體bc17葉片和莖稈的纖維素含量比野生型分別降低18.67%和22.70%, 半纖維素含量分別升高31.36%和45.76%; 野生型葉片中木質素含量顯著低于突變體， 而灰分含量顯著高于野生型,但是在莖稈中差異不明顯(表2)。細胞壁成分在不同組織中比例的差異, 可能是引起脆性特征特異表達的主要因素。

表1 突變體bc17 與野生型wyj7 農藝性狀分析Table 1 Agronomic traits of mutant bc17 and wild type wyj7

表2 野生型和突變體bc17 莖稈和葉片細胞壁成分分析Table 2 Cell wall components between wild type wyj7 and mutant type bc17 (%)

2.4 脆稈突變體bc17 莖稈的物理特征

機械強度是水稻莖稈重要的物理特征之一, 而脆稈突變是引起機械強度改變的。在成熟期時測定水稻莖稈的第2 節間和第3 節間的折斷力、拉伸力。野生型wyj7 與突變體bc17莖稈的第2 節間莖稈抗折力分別為6.38 和3.33, 第3 節間莖稈抗折力分別為7.30 和4.73。bc17莖稈第2 節間抗折力比野生型降低了47.80%, 第3 節間莖稈抗折力降低了35.20%(圖2), 這與田間觀察的莖稈脆性特征相符, 突變體所需要的莖稈折斷力明顯減少, 拉伸力的測定也驗證了這一點, 第2 節間突變體相對于野生型分別降低了63.65%。第3 節間突變體相對于野生型分別降低了60.34%。脆稈突變體莖稈抗折力比野生型顯著下降, 可能會引起倒伏的發生, 因此計算了第2 節間的倒伏指數。結果表明bc17突變體第2 節間彎曲力矩比野生型顯著下降, 引起倒伏指數比野生型升高, 但是二者差異不顯著, 說明bc17突變體抗倒伏能力較強, 可能是由于突變體株高下降, 植株重心下移產生的后果。

2.5 組織解剖學觀察

為了觀察莖稈性狀對細胞壁結構的影響, 成熟期分別對野生型wyj7 和突變體bc17莖稈第2 節間橫切樣品進行電鏡觀察, 結果發現, 突變體莖稈的厚壁組織明顯變薄, 細胞之間空隙變大, 相應地細胞密度降低, 細胞數目減少, 從而造成支撐力下降,對外力響應變得敏感(圖3)。

2.6 遺傳分析

將突變體bc17分別與野生型wyj7 正反交得到F1, 雜交后F1代表型正常。統計雜交組合F2代中的群體單株總數以及具有脆稈表型的單株數, 計算分離比例并進行卡方檢驗, 結果表明, 突變體bc17與不同品種雜交的F2群體脆稈植株分離比例均符合3∶1 (P>0.05)的理論比值(表4), 這表明bc17的脆稈特征是由一對單隱性核基因控制的。

表3 野生型和突變體bc17 倒伏指數計算Table 3 Lodging index of wild type and mutant type bc17

2.7 基因定位

用bc17/9311 雜交組合F2分離群體中的97 株脆稈表型植株作為定位群體。選取均勻分布于12 條染色體上的408 對SSR 分子標記對bc17和9311 兩親本進行多態性篩選, 將具有多態性的110 對引物檢測親本。F1基因組DNA 以及突變混池DNA (選取20 個脆性單株等量DNA 混合)進行連鎖分析, 其中7 號染色體上的SSR 引物RM500 和RM3743 與突變體具有良好的連鎖性。利用bc17/9311 雜交組合的682 株F2 脆稈表型植株擴大群體進行精細定位, 在RM500～RM3743 之間設計多個InDel 分子標記, 最終將bc17定位在UP-81 至DN-25 之間, 物理距離約162 kb 的區間內(表5 和圖4)。在水稻基因組注釋網站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上進行生物信息學分析, 結果發現定位區間內有25 個編碼蛋白, 查詢這25 個蛋白的RNA-Seq FPKM (fregments per kilobase per million) 表達量, 該區間內蛋白表達量差異較大, 其中10 個蛋白FPKM 值很低, 幾乎檢測不到; 結合基于序列比對的生物信息學的預測發現,其中 8 個蛋白預測結果為轉座相關蛋白, 成為bc17的候選基因可能性較低。通過對其中7 個功能基因測序, 在序列上沒有發現涉及功能改變的序列差異, 需要進一步進行啟動子測序或者表達分析來確定可能的候選基因。在bc17定位區間預測有功能的基因涉及到氨基轉移酶(LOC_Os07g27780)、O-甲基轉移酶(LOC_Os07g27880)、硫酯酶(LOC_Os07g 27870)等, 都有可能影響到細胞壁組分的改變, 而這些基因目前還沒有相關研究報道。除了O-甲基轉移酶在RNA-seq 數據庫中僅在葉片中表達外, 氨基轉移酶和硫酯酶全生育期表達, 其中硫酯酶在萌發前的花序中FRKM 值為9.61, 萌發后花序中FRKM值為31.63, 表達量具有時空特異性, 很可能是bc17的候選基因。

表5 bc17 基因定位部分引物Table 5 Part of the primers for bc17 gene mapping

3 討論

目前報道的許多水稻脆性突變體都伴隨著明顯的表型變化, 如植株矮小, 分蘗數減少, 結實率降低以及產量下降等, 且脆性全生育期、全組織表達, 類似的有bc3和bc12等[23,26]。bc3突變體出現輕微矮化,與野生型相比bc3突變體的莖、葉、根中纖維素含量降低了28%～36%, 而其他細胞壁組分含量沒有發生變化[26]。bc12突變體由于細胞數目的顯著減少導致植株矮化, 纖維素微纖維的方向和細胞壁組分改變致使出現脆稈表型[23]。bc17突變體雖然植株變矮,但是脆性特征比較獨特, 具有組織特異性和時間表達特異性, 與其他矮稈脆性突變體具有明顯的差異。莖稈和葉片細胞壁成分測定顯示, 與野生型相比,bc17莖稈和葉片都出現纖維素含量降低, 半纖維素含量升高。值得一提的是, 與野生型相比,bc17葉片木質素含量降低, 灰分升高, 也可能是導致葉片沒有表現出脆性的原因。

水稻脆稈性狀發生的原因, 除了涉及經典的纖維素合成途徑(纖維素合酶)、多糖生物合成轉運途徑外, 轉錄因子調控途徑以及細胞壁多糖乙酰化修飾等[27]對細胞壁的功能也起到重要的調控作用。葉亞峰等[20]發現OsMYB103L是MYB 家族轉錄因子, C端具有較高的轉錄活性, 可直接與OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9以及bc1啟動子區域結合調控他們的表達, 此外,OsMYB103L還參與GA 介導的纖維素合成途徑的調控。周奕華等發現水稻BS1蛋白為木聚糖乙酰酯酶[28], 可從木糖吡喃糖基殘基的O-2和O-3 位置的木聚糖骨架上切割乙酰基部分。在維持木聚糖主鏈上適當的乙酰化水平中起重要作用,參與次生細胞壁的形態建成, 這表明水稻次生細胞壁的生物合成過程非常復雜。本研究將bc17定位在7 號染色體分子標記UP-81 和DN-25 之間, 沒有發現相關報道的其他脆稈基因。在bc17定位區間預測有功能的基因涉及到氨基轉移酶、O-甲基轉移酶、硫酯酶等, 都有可能影響到細胞壁組分的改變, 而這些基因目前還沒有相關研究報道, 可能會為次生細胞壁合成的機制解析發現一條新的調控途徑。

農作物傳統秸稈處理如棄置農田或者直接焚燒, 由于自然狀態下降解速率緩慢, 容易造成環境污染和資源浪費[29]。水稻脆稈突變體, 由于其獨特的細胞壁組成和結構的變化, 收獲時秸稈易破碎降解, 有利于水稻秸稈的生態還田[30]。同時, 還可以將脆性材料直接作為家畜飼料, 較低的纖維素含量更有利于反芻動物消化, 具有良好的飼料應用前景[31]。水稻秸稈是可再生的生物質原料, 可以經過水解發酵產生生物乙醇[32-33]。黃峰等利用水稻脆性秸稈為原料, 利用酸預處理且酶促糖化發酵72 h 后,脆性秸稈發酵的乙醇產量可達為普通秸稈的1.1 倍[34]。bc17突變體細胞壁纖維素含量降低, 半纖維素含量升高, 有望通過優異等位基因的發掘, 應用到生產中, 從秸稈飼料化和能源化角度解決秸稈利用的難題。

4 結論

利用重離子輻照武運粳7 號(wyj7)獲得一個脆稈突變體bc17, 在抽穗后莖稈出現脆性特征, 且隨著生育期進程脆稈脆性程度增加, 葉片基本表現正常。較野生型,bc17葉片和莖稈纖維素含量顯著降低,半纖維素含量顯著升高, 厚壁組織變薄, 細胞之間空隙變大, 相應地細胞密度降低, 細胞數目減少。該性狀受一對隱性核基因控制, 被定為在7 號染色體長臂上162 kb 區間內, 生物信息學分析表明bc17可能是一個新的脆稈基因, 為進一步揭示水稻細胞壁合成機制奠定材料基礎。