水稻矮化寬葉突變體osdwl1 的生理特性和基因定位

黃 妍 賀煥煥 謝之耀 李丹瑩 趙超越 吳 鑫黃福燈 程方民 潘 剛,*

1 浙江大學農業與生物技術學院, 浙江杭州310058; 2 浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所, 浙江杭州310021

水稻是我國最重要的糧食作物之一, 對保障我國糧食安全起重要作用。然而, 隨著我國人口數量的持續增長、可耕種面積的逐年減少, 糧食安全形勢日益嚴峻[1-2]。因此, 培育高產穩產水稻新品種依舊是水稻育種工作者的重要目標之一[3]。株高是水稻重要農藝性狀之一, 直接影響水稻生物學產量,與水稻的抗倒伏及抗病蟲能力線性相關, 最終影響水稻的豐產性和穩產性[4-5]。傳統水稻品種一般表現為高稈, 矮稈則是突變性狀[4-5]。遺傳學研究顯示,矮稈性狀受主效基因或多個微效基因控制, 同時受內源激素及外源光溫水氣肥的影響[4-6]。利用正向或反向遺傳學手段, 迄今已克隆調控水稻株高的基因超過70 個, 這些基因多數與赤霉素、油菜素內酯、獨腳金內酯、生長素等激素生物合成代謝或信號傳導有關[4-5]。研究表明, 現已克隆的多數矮稈或半矮稈基因表現出“一因多效”的遺傳效應, 即引起水稻植株矮化的同時其他農藝性狀也發生改變, 如d3[7]、d10[8]、d14[9]、fc1[10]和htd1[11]具多分蘗特征;sgd2[12]和SRS5[13]與籽粒大小有關; 而DNL1[14]則表現為窄葉;dlt[15]則引起少蘗寬葉。

當然, 葉片是水稻進行光合作用的主要場所,是最重要的源器官, 其形態直接影響植株形態并最終關系到稻谷產量與品質。而葉片的長、寬、面積、厚、傾角、披垂度、卷曲度等是界定葉形態及空間姿態的重要因素[16], 因此增加葉寬將影響有效光合葉面積, 從而影響單個葉片的光合產物。研究認為, 葉片是沿基-頂軸、近-遠軸以及中-邊軸3 個軸向生長發育, 其中中-邊軸調控葉寬[17]。因此, 可以利用窄葉或寬葉突變體研究水稻葉寬調控分子機理, 迄今已克隆諸如NAL1[18]和DNL3[19]等窄葉基因, 但有關寬葉突變體卻僅有Wl[20]和dlt[15]等少量報道。

本課題組前期利用60Co 輻射誘變中秈恢復系自選1 號, 獲得一個矮化寬葉突變體, 暫名為osdwl1(Oryza sativadwarf and wider-leaf 1,osdwl1)。該突變體在苗期(約3～4 片期)就表現為寬葉, 且除上部一片完整展開葉及心葉外, 其他葉片的中上部均表現為黃葉。之后隨著葉齡的增加, 除葉片形態發生變化外, 植株還明顯矮化。本文對突變體osdwl1的基本表型、生理細胞變化及基因定位等方面進行了研究, 為進一步克隆該基因并揭示其矮化寬葉的分子細胞生理機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矮化寬葉突變體osdwl1來源于秈稻恢復系自選1 號(來源于湖北省恩施市農業科學院水稻研究所)的60Co 輻射誘變后代, 經杭州和海南連續多代回交和自交, 突變性狀已穩定遺傳。之后利用突變體osdwl1分別與原始對照自選1 號、秈稻恢復系93-11以及常規粳稻02428 雜交, 獲得osdwl1/自選1 號、osdwl1/93-11 和osdwl1/02428 三個F1并自交獲得相應F2群體, 用于突變性狀的遺傳分析和基因定位。所有材料均種植于浙江大學紫金港農業試驗站, 常規肥水管理。水稻幼苗期和抽穗開花期, 分別調查20 個單株的幼葉和劍葉寬度。水稻成熟后, 隨機選取osdwl1及自選1 號各20 株, 考查其株高、莖節長、穗長、有效穗數、每穗粒數、結實率和千粒重等主要農藝性狀。

1.2 生理指標測定

隨機選取osdwl1及自選1 號處于孕穗期(劍葉葉枕與倒二葉葉枕重合的分蘗)的劍葉、倒二葉和倒三葉的上部葉片, 根據Gong 等[21]的方法分別測定葉綠素、可溶性蛋白、H2O2、O2-和MDA 含量、以及CAT 和SOD 酶活。同時, 利用Li-6400XT 光合儀以及PAM-2000 葉綠素熒光儀分別測定劍葉、倒二葉和倒三葉相應部位的凈光合速率及Fv/Fm[22-23]。每個生理指標測定5 個生物學重復。

1.3 葉片及莖節細胞學觀察

取抽穗當天osdwl1及自選1 號劍葉的上部邊緣葉片, 用刀片切成1 mm × 2 mm 的樣品, 立即放入預冷的2.5%戊二醛固定液中并抽真空至樣品完全浸沒, 4℃固定過夜, 根據Yang 等[24]的方法制片, 于掃描電鏡(Hitachi TM-1000)和透射電鏡(JEM-1230)下分別觀察葉片表皮細胞和葉肉細胞顯微結構并拍照。同時, 選取抽穗當天osdwl1及自選1 號相同部位劍葉, 將葉片橫剪成2 mm 寬的小片段, 立即放入70% FAA 固定液并抽真空至樣品完全浸沒, 4℃固定3 d, 而后依次進行乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片以及番紅固綠染色, 最后用1︰1 的二甲苯和中性樹膠封片, 置于42℃恒溫箱處理48 h, 后于NIKON E6000 顯微鏡下觀察并拍照。此外, 根據曹劍波等[25]的方法, 選取抽穗當天osdwl1及自選1 號相同部位倒二節莖段進行樹脂半薄切片, 于倒置顯微鏡(Nikon TE2000-U)下觀察細胞形態并照相。

1.4 基因遺傳分析與定位

大田栽培條件下, 首先觀察osdwl1/自選1 號及osdwl1/93-11 的雜種F1的株高及葉片表型, 確定控制osdwl1矮化寬葉的顯隱性; 其次, 根據osdwl1/自選1 號及osdwl1/93-11 的F2群體中具有野生型表型的單株數與具有突變體表型的單株數比例, 確定控制osdwl1矮化寬葉的基因數。同時, 剪取osdwl1/02428 的F2定位群體中具有突變體性狀和野生型性狀的各10 個單株、以及其親本osdwl1和02428 的葉片, 采用CTAB 法提取基因組總DNA。選取SSR (http://www.gramene.org/)及InDel 分子標記, 利用BSA 法進行基因定位。

2 結果與分析

2.1 突變體osdwl1 的表型及主要農藝性狀

osdwl1的葉片從苗期(三至四葉期)開始, 除上部1 片完整展開葉及心葉外, 其他葉片在完整展開3～4 d 后, 葉尖開始變黃并逐步擴展至葉片中上部(圖1-A～C)。之后隨著葉齡增長,osdwl1植株高度也逐漸矮于野生型對照, 到水稻成熟期(圖 1-D, E),osdwl1株高僅有野生型對照的64.18% (表1)。進一步分析植株每一個莖節長度, 結果顯示osdwl1倒一節、倒二節、倒三節、倒四節和倒五節分別僅有野生型對照的62.86%、75.42%、79.24%、79.93%和77.03% (圖1-E, F)。倒二莖節縱切面的樹脂半薄切片結果顯示, 突變體的細胞長度明顯變短, 但細胞數目顯著增加(圖1-G, H)。由于葉片出現黃化癥狀,導致突變體osdwl1的主要農藝性狀, 如穗長、每穗粒數和結實率分別比野生型對照下降 35.60%、37.35%和42.15%, 而突變體千粒重則極顯著高于對照(表1)。

2.2 突變體osdwl1 葉片表型特征

圖1-C 及圖2-A 顯示突變體osdwl1幼苗期葉片及抽穗開花早期劍葉極顯著寬于對照, 分別增寬16.17%和12.88%。劍葉石蠟切片(圖2-B)結果顯示,osdwl1與野生型對照之間的大維管束數無顯著性差異, 但突變體的小維管束數及小維管束之間距均極顯著增加, 分別增加10.98%和27.95% (圖2-C, D);而且, 與對照相比, 突變體小維管束間的表皮細胞數顯著增加(圖2-E), 而其寬度無明顯變化(圖2-F)。同時, 利用SEM 分析突變體劍葉表皮細胞結構特征,進一步證實突變體小維管束之間的間距極顯著增加(圖2-G), 此外, 與對照相比,osdwl1劍葉下表皮的小刺毛數也極顯著增加, 達3384.85% (圖2-G, H);而其上表皮的大刺毛和小刺毛數則分別增加36.70%和211.08% (圖2-G, I)。

2.3 突變體osdwl1 的生理分析

2.3.1 葉綠素含量及其光合作用效率 圖3-A～D結果顯示, 孕穗期osdwl1除葉綠素a/b比值(圖3-D)及劍葉葉綠素含量(圖3-A～C)外, 其倒二葉、倒三葉的葉綠素a(圖3-A)、葉綠素b(圖3-B)及葉綠素總含量(圖3-C)依次極顯著下降且極顯著低于野生型對照。與野生型對照相比,osdwl1倒二葉和倒三葉的總葉綠素含量分別下降 13.48%和 26.59%。盡管osdwl1劍葉葉綠素含量無顯著性變化, 但TEM 結果(圖3-E～H)顯示突變體劍葉葉肉細胞的部分葉綠體類囊體結構松散(圖3-H), 部分已開始降解(圖3-G),這勢必影響突變體葉片的凈光合速率(圖3-I)及PSII光化學效率(Fv/Fm) (圖3-J)。結果顯示, 突變體劍葉、倒二葉和倒三葉的凈光合速率和Fv/Fm明顯低于野生型對照, 凈光合速率分別下降27.22%、28.31%和22.25% (圖3-I), 而其Fv/Fm的變化趨勢與凈光合速率基本一致, 分別下降13.34%、10.78%和20.40%(圖3-J)。含量無顯著性差異, 而osdwl1則依次升高且倒二葉和倒三葉顯著高于劍葉, 分別增加 11.44%和24.72%。為了平衡植物細胞內的活性氧含量, 如H2O2和O2-, 防止其對細胞造成損傷, 植物細胞會表達多種保護酶, 如SOD 和CAT 等抗氧化酶。因此,進一步測定了葉片的CAT (圖4-C)和SOD (圖4-D)酶活。結果顯示, 野生型劍葉、倒二葉和倒三葉間的SOD 和CAT 酶活無顯著性差異, 而突變體osdwl1則依次極顯著下降。與osdwl1劍葉相比, 其倒二葉和倒三葉的SOD 酶活分別下降8.00%和20.08%,CAT 酶活則分別減少39.84%和51.32%。

表1 突變體及其野生型的主要農藝性狀Table 1 Main agronomic traits of osdwl1 and its wild-type plants

2.3.3 MDA和可溶性蛋白含量 圖5顯示, 野生型對照的劍葉、倒二葉和倒三葉間的MDA含量(圖5-A)和可溶性蛋白含量(圖5-B)均無顯著性差異。而osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉間的MDA含量則依次顯著升高, 除劍葉外, 倒二葉和倒三葉含量顯著高于野生型對照(圖5-A); 與突變體osdwl1劍葉相比,其倒二葉和倒三葉的MDA含量分別增加50.29%和79.87% (圖5-A)。osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉間的可溶性蛋白含量依次降低且均極顯著低于野生型對照, 尤其是其倒三葉的含量極顯著低于劍葉和倒二葉, 分別下降31.93%和28.53% (圖5-B)。

2.4 遺傳分析與基因定位

osdwl1/自選1 號和osdwl1/93-11 雜交F1植株形態均正常, 說明突變性狀是由隱性位點控制。而osdwl1/自選1 號的1105 個F2群體中, χ2檢驗正常植株數(836)與具矮化及寬黃葉的植株數(269)的分離比 符 合 3 ∶1 [χ2= 0.25 < 3.84 (χ2(0.05,1))]; 而osdwl1/93-11 的612 個F2定位群體中, 正常單株數(455)與矮化及寬黃葉單株數(157)的分離比亦符合3∶1 [χ2=0.46 < 3.84 (χ2(0.05,1))]的孟德爾遺傳定律。這些結果表明osdwl1的矮化及寬黃葉性狀由單隱性核基因控制。

利用osdwl1/02428 的F2群體中具有矮化及寬黃葉性狀的673 個單株作為基因定位群體。為了定位OsDWL1基因, 首先分別提取osdwl1/02428 F2群體中的10 株野生型表型和10 株具有矮化寬葉性狀的單株基因組DNA, 分別等量混合成正常基因池和突變基因池。合成水稻12 條染色體上的500 對SSR標記及50 對InDel 標記, 逐條對02428 和突變體osdwl1進行多態性分析, 而后選用均勻分布于12 條染色體上的多態性分子標記, 利用BSA 法分析其與OsDWL1基因間的連鎖性關系。結果發現水稻6 號染色體短臂上的SSR 標記RM7399、RM19288、RM3805 和RM19549 與OsDWL1緊密連鎖。利用這4 個標記對osdwl1/02428 的F2群體中的673 個矮化寬葉單株進行基因型分析, 發現 RM7399、RM19288、RM3805 和RM19549 的交換單株分別是80、23、19 和121 株, 初步將OsDWL1基因定位在RM19288 和 RM3805 之間。為進一步精細定位OsDWL1基因, 繼續合成位于RM19288 和RM3805之間的10 對SSR 和InDel 標記(附表1), 其中2 對標記在02428 和突變體osdwl1間存在多態性, 利用這2 對標記將OsDWL1基因限定在RM19297 與ID269-2 之間, 物理距離約333 kb, 橫跨AP001168、AP002838、AP000391 和AP000559 四個BAC (圖6), 其間有 EST 支持的 ORF 為 37 個(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/) (表2)。

表2 定位區間內的基因及功能注釋Table 2 Gene names and their functional annotations in the target interval

3 討論

株高是影響農作物株型、生物量、抗倒性及機械收割的重要因素[4-5]。研究表明, 植株過高是引起水稻倒伏的最主要原因[4-5]; 而植株過矮, 會造成水稻生長量不足, 故適當增加株高, 不僅可以降低葉面積密度(葉面積指數與株高的比值), 還有利于CO2擴散及中下部葉片吸收利用太陽光能, 增加光合速率, 進而提高植株生物量[26]。影響水稻株高的因素包括穗長、節間數和節間長度, 除少部分因穗長和節間數量發育缺陷的突變體外, 大多數矮稈水稻是由于節間長度變短造成的[4-5]。本研究中osdwl1的節間長度均極顯著比野生型對照縮短, 導致osdwl1株高顯著低于野生型對照(圖1-E, F), 莖節的樹脂半薄切片證實節間縮短的根本原因在于突變體細胞長度更小(圖1-H)。

植物株高既受諸如光溫水氣肥等外界環境的影響, 也受植物內源激素及基因的調控, 但歸根結底受內源基因網絡的精細調控[4-6]。大量研究結果證實,水稻株高一般受1～3對主效基因控制, 但也受微效基因調控[4-5]。迄今已證實, 調控株高的基因包括GA代謝途徑的DELLA蛋白基因、參與油菜素內酯和獨腳金內酯合成代謝的細胞色素P450基因與鈣調蛋白、RNA編輯相關的PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白基因以及核糖體蛋白基因等[4-5]。如水稻編碼PPR蛋白的OGR1基因的功能缺失突變體ogr1表現為矮化及不育等特性[27]; 與油菜素內酯合成代謝相關的水稻P450基因CYP90D2/D2的缺失突變[28]、擬南芥鈣調蛋白基因DWL1的部分缺失過表達轉基因后代均表現矮化癥狀[29]; 參與GA信號通路的水稻DELLA蛋白基因SLR1的功能缺失也導致水稻矮化[30]; 此外, 擬南芥編碼核糖體蛋白L10基因SAC52的突變可以恢復acl5-1突變體的矮化癥狀[31]。在本研究的OsDWL1基因的定位區間內(圖6), 已克隆了一個矮化基因, 即LOC_Os06g03710, 該基因DLT/OsGRAS-32編碼一個GRAS蛋白(GAI-RGA-SCR), 其雙堿基缺失突變體d62表現為矮化少蘗、寬葉濃綠等特征[32]。本研究中的osdwl1則表現為矮化少蘗、寬葉黃化(圖1), 因此與d62性狀不完全一樣。進一步通過測序分析osdwl1中的DLT基因, 證實其序列與野生型對照一致。而與報道相關的導致水稻矮化相關的基因分別為PPR蛋白基因(LOC_Os06g03530和LOC_Os06g03570) 、 細 胞 色 素P450基 因(LOC_Os06g03930)、鈣調蛋白基因(LOC_Os06g03676)、以及核糖體蛋白基因(LOC_Os06g03790) (表2)。當然,候選基因的最終確定要依賴于這些基因的測序分析及遺傳互補驗證。

大量研究表明, 矮化基因一般具有“一因多效”的特點, 即矮化突變體除植株矮化外, 還伴隨分蘗、葉片和籽粒等組織器官的變化[4-5]。本研究中osdwl1除表現矮化少蘗外, 葉片從苗期開始就表現為黃化寬葉特性(圖1和圖2)。研究表明, 葉片黃化是葉片衰老的重要外在表現, 而其內在表現則為程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD), 并由此帶來葉綠體降解、蛋白質降解、ROS (reactive oxygen species)累積、膜脂過氧化以及光合速率下降等生理生化變化[32]。因此, 葉綠素含量和葉片凈光合速率是衡量葉片衰老的重要生理指標[33]。本研究結果顯示, 突變體osdwl1的倒二葉和倒三葉的總葉綠素含量及其光合速率均極顯著低于其野生型自選1號(圖3), 預示其葉片已開始衰老(圖1)。伴隨葉片衰老, 突變體葉綠體也開始降解(圖3), 進而造成葉綠體中的電子傳遞鏈受到抑制, 致使H2O2和O2-等ROS急劇增加[34-35](圖4-A, B)。同時, 過量ROS將作用于細胞膜脂質, 使其過氧化而產生大量MDA[34-35](圖5-A)。與此同時, 為了清除細胞內的過多ROS并保護細胞膜系統, 正常植物細胞會及時啟動屬于可溶性蛋白的抗氧化酶, 如SOD和CAT的表達[36-37]。其中, SOD是的專一作用酶[36-37], 突變體osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉的SOD酶活極顯著低于野生型自選1號(圖4-D), 從而導致突變體葉片中的O2-含量顯著增加(圖4-A)。而CAT是作用于H2O2的保護酶[36-37], 突變體osdwl1的倒二葉和倒三葉之間的CAT酶活顯著低于野生型(圖4-C), 致使其倒二葉和倒三葉中的H2O2顯著增加(圖4-B)。

4 結論

osdwl1是一個新鑒定到的矮化少蘗、寬葉黃化的突變體, 其寬葉黃化癥狀始于三至四葉期幼苗。與野生型對照相比,osdwl1的劍葉、倒二葉和倒三葉的葉綠素含量極顯著降低, 從而導致其凈光合速率極顯著下降。osdwl1倒二葉和倒三葉CAT、SOD 活性極顯著下降, 降低其清除H2O2的能力, 導致ROS明顯增加并促使細胞膜脂過氧化, 致使MDA 含量極顯著升高。遺傳分析表明,osdwl1的矮化寬葉性狀由一對隱性核基因控制, 進一步利用圖位克隆技術將OsDWL1定位于6 號染色體短臂的RM19297 與ID269-2 之間, 其間物理距離約333 kb, 這為進一步克隆該基因并揭示其矮化寬黃葉分子生理機理奠定基礎。

附表1 用于OsDWL1 基因定位的分子標記Table S1 Molecular markers used for OsDWL1 gene mapping