不同產地野菊花HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別研究

謝蘇夢，季巧遇，呂 尚，張 堯，鄒瀚霖，汪 弟，饒 毅, ，魏惠珍, *

不同產地野菊花HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別研究

謝蘇夢1，季巧遇2，呂 尚1，張 堯3，鄒瀚霖1，汪 弟1，饒 毅1, 3，魏惠珍1, 3*

1. 江西中醫藥大學，江西 南昌 330004 2. 華潤江中藥業技術中心，江西 南昌 330004 3. 中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006

建立野菊花藥材HPLC指紋圖譜，并進行化學模式識別。采用Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，檢測波長334 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL，建立野菊花藥材HPLC指紋圖譜，結合相似度評價、聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析等模式識別方法，對不同產地野菊花藥材進行質量評價。建立的指紋圖譜方法符合方法學要求，29批野菊花藥材HPLC指紋圖譜有10個共有峰，相似度均在0.91以上；通過聚類分析將樣品按不同產地分為2大類；主成分分析與聚類分析結果一致；最后采用正交偏最小二乘-判別分析篩選出了不同批次野菊花藥材的6個差異標志物，通過對照品指認，確定了10號峰為蒙花苷、5號峰為3,4-二咖啡酰奎寧酸、3號峰為木犀草苷、1號峰為綠原酸。建立的指紋圖譜方法穩定、可靠、重復性好；結合化學模式識別可用于野菊花藥材的質量品質評價。

野菊花；HPLC指紋圖譜；化學模式識別；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；蒙花苷；3,4-二咖啡酰奎寧酸；犀草苷；綠原酸

野菊花為菊科植物野菊L.的干燥頭狀花序[1]。性微寒，味苦，歸心、肝經，廣泛分布于我國東北、華北、華中、華東及西南地區，是臨床常用的清熱瀉火藥，具有疏散風熱、消腫解毒的功效[2]。野菊花主要活性成分為黃酮類和酚酸類[3]，《中國藥典》2020年版的指標成分為單一成分蒙花苷，而《香港中藥材標準》第8期的指標成分是綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷。文獻報道[4-5]不同產地野菊花藥材中黃酮類、酚酸類成分含量差異較大。目前對野菊花質量控制研究主要集中在指標成分含量測定[5]、指紋圖譜分析中[6-7]，但多數是從方法學角度考察色譜條件，未能較直觀地反映出不同批次野菊花藥材的差異標志物。

中藥指紋圖譜能系統反映出中藥各組分信息，廣泛應用于中藥質量控制領域，但其數據量大，需要借助多種中藥指紋圖譜數據處理方法進行深度、科學地分析[8]。目前多使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件對獲得中藥色譜指紋圖譜數據進行快速匹配和識別，但該軟件不能多方面反映出藥材整體質量，無法直觀反映出不同批次藥材的差異標志物[9]。而化學模式識別方法通過分析實驗獲得的大量數據，最大限度地提取有效化學信息，對數據進行深入分析。在中藥指紋圖譜數據分析中應用較多的化學模式識別方法包括聚類分析法、主成分分析法和偏最小二乘法[10]。采用指紋圖譜和化學模式識別相結合的方法，可以更加全面、科學、客觀地評價藥材質量，目前也越來越多地應用于中藥材質量控制和評價領域[11-13]。因此，本研究采用HPLC法建立野菊花藥材指紋圖譜，結合化學模式識別方法對指紋圖譜進行綜合分析，為野菊花藥材的質量評價研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀；AB-104N萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；AUW-220D十萬分之一電子分析天平（日本SHIMADZU公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

1.2 材料

綠原酸（批號110753-201314）、咖啡酸（批號111720-201703）、木犀草苷（批號111720-201307）、3,5-二咖啡酰奎寧酸（批號111782-201807）、4,5-二咖啡酰奎寧酸（批號111894-201102）、蒙花苷（批號111528-201710），以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；3,4-二咖啡酰奎寧酸對照品（批號15101132）購自成都康邦生物科技有限公司；所有對照品質量分數均大于98%。乙腈為色譜純（美國Anaqua安可化學）；水為實驗室自制超純水；其余試劑均為分析純。本實驗搜集了湖北麻城、棗陽、羅田；安徽金寨、廬江、桐城、霍山共7產地29批次的野菊花藥材，經江西中醫藥大學羅曉健教授鑒定為菊科植物野菊L.的干燥頭狀花序，樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，85% B；5～25 min，85%～80% B；25～40 min，80%～70% B；40～50 min，70%～35% B；50～60 min，35% B）；檢測波長：334 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。

表1 野菊花藥材樣品信息

2.2 供試品溶液的制備

取野菊花樣品粉末（過三號篩）約0.5 g。精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷對照品適量，于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制得各對照品母液；再精密吸取7種對照品母液適量，加50%甲醇稀釋，制得綠原酸為25.89 μg/mL、咖啡酸為20.14 μg/mL、木犀草苷為3.828 μg/mL、3,4-二咖啡酰奎寧酸為21.32 μg/mL、3,5-二咖啡酰奎寧酸為19.73 μg/mL、4,5-二咖啡酰奎寧酸為3.682 μg/mL、蒙花苷為24.66 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 按“2.2”項下方法制備1份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，以3.5-二咖啡酰奎寧酸（6號峰）為參照峰（S），計算10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%[14]。

2.4.2 重復性試驗 按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，以3,5-二咖啡酰奎寧酸（6號峰）為參照峰（S），計算10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%[14]，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h時進樣，以3,5-二咖啡酰奎寧酸（6號峰）為參照峰（S），計算10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%[14]。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

將29批野菊花藥材按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，將29批色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1版本）”軟件進行評價，設定S1樣品的圖譜為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，采用平均數法結合多點校正生成對照圖譜，并進行相似度評價，29批野菊花藥材HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜見圖1、2。共標定了10個共有峰，通過與對照品圖譜比對，指認了其中7個色譜峰，見圖3，即峰1為綠原酸、峰2為咖啡酸、峰3為木犀草苷、峰5為3,4-二咖啡酰奎寧酸、峰6為3,5-二咖啡酰奎寧酸、峰8為4,5-二咖啡酰奎寧酸、峰10為蒙花苷。峰6出峰時間居中、峰面積較大且分離度良好，故選擇3.5-二咖啡酰奎寧酸（6號峰）為參照峰（S），計算樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間RSD均小于0.50%，表明這29批樣品中10個共有峰保留時間較穩定；但共有峰相對峰面積RSD為24.50%～89.08%，相差較大，表明各批次間這10個共有峰所代表化合物的含量存在較大差異。以對照指紋圖譜為對照，計算各批次樣品相似度，結果見表2，29批樣品相似度均大于0.91。

圖1 29批野菊花藥材的HPLC指紋圖譜

圖2 野菊花藥材的對照指紋圖譜

1-綠原酸 2-咖啡酸 3-木犀草苷 5-3,4-二咖啡酰奎寧酸 6-3,5-二咖啡酰奎寧酸 8-4,5-二咖啡酰奎寧酸 10-蒙花苷

表2 29批野菊花藥材相似度評價結果

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類分析（clustering analysis，CA） 利用SPSS 22.0軟件，以野菊花HPLC指紋圖譜的10個共有峰的峰面積為變量，采用組間聯接的聚類方法，以平方歐式距離為樣品間距離進行聚類分析，結果見圖4，各批次野菊花樣品主要分為2大類、6小類：S1～S5、S21-S23、S11～S15、聚為一大類（I組），產地均為湖北, 其中S1～S5聚為一小類（Ia組）產地為湖北麻城、S21～23聚為一小類（Ib組）產地為湖北羅田、S11～S15聚為一小類（Ic組）產地為湖北棗陽；S24～S26、S16-S20、S6～S10、S27～S29聚為一大類（II組），產地均為安徽，其中S24～S26聚為一小類（IIa組）產地為安徽桐城、S16-20聚為一小類（IIb組）產地為安徽廬江、S6～S10、S27～S29聚為一小類（IIc組）產地為安徽金寨和安徽霍山，考慮這2個產地均為安徽省六安市，野菊花藥材差異較小，故分為一類。

圖4 29批野菊花藥材聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 用SPSS 22.0軟件對各共有峰峰面積進行標準化處理后，對29批野菊花藥材指紋圖譜所得的10個共有峰進行主成分分析，結果見表3，以特征值＞1為提取標準，得到2個主成分（1、2），其累計方差貢獻率為85.769%，可代表野菊花指紋圖譜共有峰的大部分信息。旋轉后的主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和方向，載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大[15]，主成分載荷矩陣見圖5，較直觀反映出各變量對主成分的貢獻率：10個共有峰對第1主成分多成正相關，共有峰4、10、9、5、3對第1主成分貢獻較大；共有峰6、8、1、9對第2主成分貢獻較大，共有峰2、3、7對第2主成分成負相關。再根據主成分載荷矩陣，計算主成分得分，2個主成分得分表達式：1＝0.3021＋0.2672＋0.3523＋0.4224＋0.3645－0.0126＋0.2897＋0.2328－0.3509－0.37910；2＝0.3791－0.1512－0.1223＋0.1384＋0.3055＋0.5186－0.3497＋0.4198＋0.2929＋0.23310。通過將各特征向量標準化后，代入主成分得分表達式中計算29批樣品的主成分得分。再根據各主成分的貢獻率，計算出綜合得分，其公式為綜＝0.4931＋0.3642，主成分得分和綜合得分結果見表4，可反映S1～S5、S21～S23、S11～S15批次樣品綜合得分幾乎均為正值，將該13批湖北樣品聚為一類；S24～S26、S16～S20、S6～S10、S27～S29批次樣品綜合得分均為負值，因此將該16批安徽樣品聚為一類，這與聚類分析結果完全一致。根據綜合得分＝相應的因子得分×相應主成分的特征值的平方根，綜合得分越高，表明峰面積相對越大，藥材含量相對越高[16]，可知：S1～S5、S21～S23、S11～S15批次樣品綜合得分排名靠前，S24～S26、S16～S20、S6～S10、S27～S29批次樣品排名靠后，從主成分分析及綜合得分角度來看，本研究中湖北產地野菊花藥材含量相對優于安徽產地。

表3 特征值及累積方差貢獻率

圖5 10個共有峰2個主成分的排序坐標圖

用變量統計分析軟件（SIMAC14.1）對29批野菊花樣品進行主成分分析，變量為指紋圖譜中所得到的共有峰的相對峰面積，以此構建29×10的原始數據矩陣，Par作為標度化方式，繪制出主成分分析圖，見圖6-A，原點左側為安徽產地，右側為湖北產地，不同批次的野菊花樣品呈現較明顯的分類，與聚類分析的結果一致。

表4 主成分得分和綜合得分

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 為了進一步尋找不同批次野菊花的差異標志物，采用SIMAC 14.1軟件對樣品數據進行OPLS-DA分析，將29批樣品的10個共有峰導入SIMAC 14.1軟件中，建立OPLS-DA模型，模型得分圖見圖6-B，湖北與安徽產地野菊花分布在中線兩側，表明29批野菊花樣品被較好地分為2類，由模型分析驗證參數可知，結實率參數2為1，區分參數2為0.96，預測參數2為0.903，均大于0.5且接近于1，說明模型穩定且具有良好的預測準確性。為防止該模型過擬合造成假陽性結果，設置分類矩陣變量隨機排列200次做置換檢驗，得置換檢驗圖7-A，2回歸線在軸截距為0.27、2回歸線在軸截距為?0.943，說明所建立的模型沒有出現過擬合現象，可用于判別分析29批樣品的組間差異。OPLS-DA模型中變量重要性投影值（variable Importance for the projection，VIP值）可直觀反映出具有統計學意義的差異標志物，結果見圖7-B，在95%置信區間內，篩選出VIP＞1.0的色譜峰為差異標志物，并通過對照品指認，具有統計學意義的6個差異標志物的影響程度依次為4號峰＞10號峰（蒙花苷）＞5號峰（3,4-二咖啡酰奎寧酸）＞3號峰（木犀草苷）＞9號峰＞1號峰（綠原酸）。計算差異標志物峰面積占共有峰峰面積占比，可知29批樣品的差異標志物中蒙花苷平均占比最高，為32.37%，綠原酸占比其次，為13.03%，且這些成分RSD均大于21.27%，表明這些成分在各批次間含量差異較大。

圖6 PCA(A)和OPLS-DA (B) 得分散點圖

圖7 OPLS-DA置換檢驗圖(A) 和29批樣品各成分VIP圖(B)

根據以下文獻可知，以上這些成分同樣是野菊花的活性成分。張金杰等[17]采用微量肉湯稀釋法發現野菊花總黃酮及蒙花苷單體對葡萄牙假絲酵母的體外抗菌活性較好。許韓婷等[18]發現蒙花苷可通過抑制NF-κB及其相關信號通路的活化來減少炎性黏附和炎性因子分泌，從而緩解脂多糖引起的血管內皮細胞炎癥損傷，發揮抗炎藥理活性。戴勝[19]采用HSC細胞對化合物進行四甲基偶氮唑鹽比色法保肝活性篩選，發現3,4-二咖啡酰奎寧酸活性較為突出。趙晶晶[20]應用四甲基偶氮唑鹽比色法和細胞病變法2種方法對木犀草苷等黃酮類化合物進行研究，發現木犀草苷具有體外抗巨細胞病毒體作用，Shan等[21]發現綠原酸通過減弱核因子κB和JNK/AP-1信號通路活化來抑制脂多糖誘導的環氧化酶-2表達，抑制前列腺素E2的生成來起到抗炎作用。

綜上可知，結合OPLS-DA中VIP值篩選、對照品指認及相關藥效學文獻，說明蒙花苷、3，4-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、綠原酸可作為野菊花藥材的差異標志物。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察和色譜條件優化

本研究考察了不同提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇和乙醇）、不同提取方式（回流、超聲）、不同提取時間（20、30、40 min）對野菊花藥材指紋圖譜色譜圖的影響，結果發現：50%甲醇提取的色譜峰較多，超聲和回流提取無明顯差異，不同提取時間也無明顯差異，故選擇50%甲醇超聲提取30 min為最優提取方法。

通過考察甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸為流動相體系進行梯度洗脫時，發現乙腈-0.1%磷酸作為流動相，各色譜峰分離度較好，峰型較佳，基線較平穩；通過在190～400 nm全波長掃描，比較各波長色譜圖，發現在334 nm處色譜峰響應值最佳，故選擇334 nm作為野菊花藥材指紋圖譜的檢測波長。

3.2 共有峰確定

本研究建立的野菊花藥材HPLC指紋圖譜方法確定了10個共有峰，共有峰峰面積占比85%以上，能較好地代表野菊花整體質量；通過對照品指認，確定了7個化合物，分別綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷，與陳寧等[6,22]研究結果基本一致。因此本研究所建立的指紋圖譜能較全面反映野菊花所包含的化學信息，為日后野菊花中該類成分定量研究奠定基礎，為其質量控制提供參考。

3.3 野菊花分類及差異標志物篩選

前期對指紋圖譜數據處理通常是采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，而使用化學模式識別結合指紋圖譜的方法正越來越多地應用于中藥質量控制及評價領域[23-25]，可目前有關野菊花指紋圖譜結合化學模式識別的研究相對較少，本研究通過采用指紋圖譜結合化學模式識別方法，通過聚類分析、主成分分析、最小偏二乘-判別分析這三種主要的化學模式識別方法，對不同產地野菊花指紋圖譜數據進行處理，研究顯示，聚類分析、主成分分析結果一致，都將不同產地樣品聚為一類，且根據綜合得分排序可知，本研究中湖北產地野菊花得分靠前，與韓正洲[4]結論一致；最后用SIMAC軟件進行PCA分類，采用OPLS-DA模型中VIP值篩選出6個具有統計學意義的差異標志物，并通過對照品指認出影響較大的化學成分，其余未知色譜峰可通過液相-質譜聯用等手段進一步確定。通過比較差異標志物峰面積占共有峰峰面積占比，可初步得知蒙花苷、3,4-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、綠原酸等成分在各批次間含量差異較大，且《香港中藥材標準》第8期中野菊花指標成分為綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷，表明在對野菊花的質量控制研究中不能僅關注蒙花苷的質量變化，還應重點關注上述其他成分的質量變化。

綜上，本實驗采用指紋圖譜結合化學模式識別的方法對不同產地野菊花藥材進行綜合分析，對不同產地野菊花藥材進行聚類分析、主成分分析及綜合評分，采用OPLS-DA快速篩選出了不同產地野菊花的差異標志物，為評價野菊花藥材的質量及品質提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on establishment of HPLC fingerprints and chemical pattern recognition offrom different regions

XIE Su-meng1, JI Qiao-yu2, LV Shang1, ZHANG Yao3, ZOU Han-lin1, WANG Di1, RAO Yi1,3, WEI Hui-zhen1,3

1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. China Resources Jiangzhong Pharmaceutical Technology Center, Nanchang 330004, China 3. National Engineering Research Center for Manufacturing Technology of Traditional Chinese Medicine Solid Preparation, Nanchang 330006, China

To establish an HPLC fingerprint ofmedicinal materials and perform chemical pattern recognition.Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was used; Mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid, gradient elution; Detection wavelength was 334 nm; Flow rate was 1 mL/min; Column temperature was 30 ℃; Injection volume was 10 μL. HPLC fingerprints ofmedicinal materials was established, combined with similarity evaluation, cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis and other pattern recognition methods, quality evaluation ofmedicinal materials from different places.The established fingerprint method met the method requirements. The 29 batches ofmedicinal materials had 10 common peaks in the HPLC fingerprint, and the similarity was all above 0.91; The samples were divided into two categories according to different origins through cluster analysis; The results of principal component analysis and cluster analysis were consistent; Finally, the orthogonal partial least squares-discriminant analysis was used to screen out six different markers of different batches of wild chrysanthemum medicinal materials. Through the identification of the reference substance, it was determined that peak 10 was montmorrin and peak 5 was 3,4-dicaffeoylquinic acid, peak 3 was luteolin, peak 1 was chlorogenic acid.The established fingerprint method is stable, reliable, and reproducible; Combined with chemical pattern recognition, it can be used for the quality evaluation ofmedicinal materials.

L.; HPLC fingerprint; chemical pattern recognition; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discri-minant analysis; montmorrin; 3,4-dicaffeoylquinic acid; luteolin; chlorogenic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2021)24 - 7616 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.024

2021-05-06

江西中醫藥大學中藥學一流學科專項科研基金項目（5251800280）；2019年度江西省中醫藥管理局科技計劃項目（2019A005）

謝蘇夢（1995—），在讀碩士，從事藥物質量控制研究。Tel: 18379973259

魏惠珍，碩士生導師，副主任藥師，從事藥物質量控制研究和新藥研發。Tel: 13870939636 E-mail: weihuizhen101@126.com

[責任編輯 時圣明]