基于網絡藥理學與分子對接技術的鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”機制及其質量標志物預測分析

張雨恬，伍振峰，黃 藝，章 俊，張 詢，林瑞華，萬 娜*，楊 明*

基于網絡藥理學與分子對接技術的鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”機制及其質量標志物預測分析

張雨恬1, 2，伍振峰1，黃 藝3，章 俊4，張 詢1，林瑞華1，萬 娜3*，楊 明1*

1. 江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330004 3. 江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004 4. 南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006

應用網絡藥理學和分子對接方法，對鮮竹瀝發揮“咳、喘、痰”作用的機制及潛在的質量標志物（quality marker，Q-Marker）預測分析。采用干餾法和火烤法制備鮮竹瀝，對鮮竹瀝的指紋圖譜進行研究，篩選并預測其中14個成分的潛在作用靶點及通路，結合文獻數據庫分析確定“咳、喘、痰”病癥的靶基因；取藥物與疾病交集基因，將交集基因上傳String數據庫進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，利用Rstudio的clusterProfiler功能對交集基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；預測鮮竹瀝的Q-Marker，并運用分子對接軟件對部分關鍵靶點及其對應成分進行分子對接，驗證網絡分析結果。采用指紋圖譜研究得到8批干餾法、火烤法的鮮竹瀝主要活性成分，經網絡藥理學及分子對接分析鮮竹瀝對“咳、喘、痰”病癥的治療作用，推測鮮竹瀝的Q-Marker為香草酸、對乙基苯酚、丁香醛、二氫丁香酚、對乙烯基愈創木酚，主要通過調節炎癥反應、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路等重要生物通路來發揮止咳、平喘、化痰的作用。通過預測鮮竹瀝的Q-Marker，為提升其質量控制標準奠定了基礎，同時也為鮮竹瀝功效關聯物質的研究及作用機制的闡釋提供參考，為其二次開發以及擴大臨床使用范圍提供參考依據。

鮮竹瀝；網絡藥理學；質量標志物；分子對接；止咳；化痰；平喘；香草酸；對乙基苯酚；丁香醛；二氫丁香酚；對乙烯基愈創木酚

竹子為禾本科多年生常綠喬木狀植物，其分布廣、品種多，在世界范圍內約87個屬、1500多個種。鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹McClure、凈竹McClure及同屬數種植物的鮮桿經加熱后自然瀝出的液體，性味甘、苦、寒，入心、胃經，具有清熱化痰、鎮驚利竅之功效，鮮竹瀝在古代被中醫譽為“痰家圣劑”，《神農本草經》記載：“竹葉，味苦平，主咳逆上氣溢筋急，惡瘍，小蟲；竹根，益氣止渴，補虛下氣；竹汁，主風庢實，通神明，輕身益氣”[1]。臨床多用于治療肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶、中風舌強、痰涎壅盛、小兒痰熱驚風等癥[2]。鮮竹瀝是中藥品種鮮竹瀝口服液、復方鮮竹瀝液的主要原料藥，也是竹類植物在臨床上常用的藥用制劑。鮮竹瀝的古法炮制工藝有燒制法和干餾法，分別載于唐朝《急備千金藥方》[3]：“取淡竹斷兩頭節，火燒中央，器盛兩頭得汁”；明朝《本草綱目》[4]：“以竹截長五六寸，以瓶盛，倒懸，下用一器承之，周圍以炭火逼之，其油瀝于器也”。

鮮竹瀝化學成分復雜，主要含有揮發性成分、氨基酸、黃酮類成分、維生素及微量元素等。據國家藥品監督管理局統計，處方中含鮮竹瀝的中成藥有16種（包括去痰靈口服液、瀝水調脂膠囊等），含鮮竹瀝的中藥方劑有81條（包括阿膠飲子、八仙膏、白術和中湯等）。同時，鮮竹瀝也被開發成具有一定食用價值的飲料（包括鮮竹瀝飲料、蛇膽枇杷瀝、無花果飲料等）。但目前鮮竹瀝現行質量標準水平較低，導致市售產品存在炮制方法混亂、物質成分不清晰等問題，嚴重影響了鮮竹瀝臨床用藥的安全性和有效性。

中藥的臨床療效取決于其所含化學成分（群）的特征，采用多種分析技術手段構建整體質量評價體系成為近年來中藥標準化的發展方向。中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）是劉昌孝院士[5]近年來提出的中藥質量評價與質量控制的核心概念，其基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”[6]，目前已用于藥材、飲片、復方Q-Marker的研究。Q-Marker概念的提出，為中藥的質量控制研究指明了方向，為后續研究中藥發揮作用的機制奠定了基礎。

網絡藥理學是建立在系統生物學和網絡生物學基礎上的研究方法，能夠推動對藥物作用機制的認識，加速藥物靶點篩選以及生物標志物的發現[7-8]，清華大學李梢教授于1999年首次以“網絡靶標”為特點進行了一系列開拓性探索[9]；2002年提出中藥方劑發揮“多因微效”的整體療效調節作用機制[10]；2007年利用生物信息學方法首次構建出中醫寒熱證生物分子網絡及其網絡調節效應及框架[11-13]，2013年提出中藥網絡藥理學的理論、方法論與應用，并使用網絡藥理學方法進行中藥復方作用機制解析的研究工作[14]，隨著網絡藥理學的影響力和應用日益廣泛，研究者通過運用各大數據庫進行藥物與疾病相關靶點信息的搜集、預測與篩選，構建藥物-靶點-疾病相互作用網絡，進行靶標基因富集分析，從分子機制方面揭示成分在疾病預防或治療方面發揮效用的途徑，闡明中藥“多成分-多靶點-多途徑”的治療特點[15]，是解析藥物及治療對象之間的分子關聯規律，符合中醫藥特色的科學研究方法。

鮮竹瀝作為臨床上常用止咳、平喘、祛痰的中藥，其功效已明確，但該中藥發揮治療作用的藥效物質基礎、作用機制卻不甚清晰，因此本研究從Q-Marker的“五原則”出發，通過對鮮竹瀝的目標化學成分的潛在病癥靶點進行映射，結合傳統功效進行分組，結合網絡藥理學方法，從化學和生物信息角度預測分析鮮竹瀝功效的潛在Q-Marker及分子機制，為鮮竹瀝的質量控制及后續研究開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型氣質聯用色譜儀（GC-MS，美國Agilent公司）；MS-105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500B型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1650-W型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；TD5001C型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

竹子采自江西南昌灣里區，經江西中醫藥大學曹嵐副教授鑒定為2～3年生禾本科剛竹屬毛竹(Carr.) Mitford cv.的莖稈。對照品愈創木酚（質量分數100%，批號100491-201902）、苯甲酸（質量分數99.9%，批號100419-201703）購自中國食品藥品檢定研究院；4-乙基愈創木酚對照品（質量分數≥99%，批號Y03M8C30736）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品醋酸（批號CHB201106）、糠醛（批號CHB210222）、糠醇（批號CHB210223）、4-甲基愈創木酚（批號CHB210223）、對乙基苯酚（批號CHB210123）、對乙烯基愈創木酚（批號CHB210111）、紫丁香醇（批號CHB201107）、二氫丁香酚（批號CHB210308）、香蘭素（批號CHB210107）、香草酸（批號CHB210305）、丁香醛（批號CHB201130）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質量分數均≥98%；乙腈、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 GC-MS方法

2.1.1 色譜條件 123-1334 Aglient DB-624毛細管色譜柱（30 m×320 μm×1.8 μm）；載氣為氦氣，柱體積流量為1.0 mL/min；進樣口溫度為280 ℃；分流比5∶1；程序升溫：起始溫度30 ℃，保持5 min；以3 ℃升溫至40 ℃，保持4 min；以5 ℃/min升溫至60 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至80 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至110 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至144 ℃，保持0 min；以3 ℃/min升溫至180 ℃，保持0 min；以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持0 min；進樣量為1.0 μL。

2.1.2 質譜條件 四極桿溫度150 ℃；電離源為標準電子轟擊源（EI），離子源溫度230 ℃；電子倍增管電壓2 447.06V；掃描范圍/50～650。

2.2 樣品制備

2.2.1 干餾法 選取2～3年生毛竹，鋸成約40 cm段，去節，將其置于干餾裝置內，固定溫度，從竹瀝滴出開始計時，收集鮮竹瀝液，于4 ℃保存。

2.2.2 火烤法 選取2～3年生毛竹，鋸成約40 cm段，去節，用酒精噴燈加熱中部，收集兩端流出的竹瀝，烤至竹變黑且無汁液流出，收集鮮竹瀝液，于4 ℃保存。

按以上方法各制備8批（S1～S8）鮮竹瀝樣品。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品5 mL，用萃取劑二氯甲烷（色譜級）以1∶1萃取2次，靜置20 min，分層后取下層，合并萃取液，過0.45 μm微孔濾膜，于4 ℃保存，即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取對照品愈創木酚、苯甲酸、4-乙基愈創木酚、醋酸、糠醛、糠醇、4-甲基愈創木酚、對乙基苯酚、對乙烯基愈創木酚、紫丁香醇、二氫丁香酚、香蘭素、香草酸、丁香醛適量，以甲醇溶解，得到適宜質量濃度的混合對照品溶液。

2.5 指紋圖譜建立及相似度評價

各取8批干餾法、火烤法制得的鮮竹瀝，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法進行檢測，記錄鮮竹瀝色譜圖，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）軟件，以S8的指紋圖譜作為參照圖譜，采用平均數法，進行多點校正和色譜峰匹配，自動匹配生成指紋圖譜共有模式。相似度評價結果，并對鮮竹瀝的不同制備工藝的共有成分進行篩選。

2.6 鮮竹瀝成分篩選方法

通過比對指紋圖譜鮮竹瀝2種工藝下的物質成分，發現共有峰，并結合TCMSP中藥系統藥理數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）中收錄的化學成分，按以下方式進行篩選：（1）該中藥成分在部頒或局頒標準中規定的Q-Marker；（2）通過文獻數據庫可以搜索得到的已有明確藥理活性的化合物；（3）含量相對較高的化合物。

2.7 候選化合物靶點預測

通過化合物CAS號在PubChem數據庫尋找化合物的SMILES號，將化合物SMILES上傳至SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction. ch/）網站進行靶點預測，以“Probability”≥0.05作為標準篩選藥物成分靶點。

2.8 “咳、喘、痰”疾病靶點獲取

通過CNKI數據庫與Web of Science數據庫查閱文獻發現“痰”與“氣道黏液高分泌”存在著極為緊密的聯系[16]，因此選擇“phlegm”“hypersecretion of airway mucus”作為痰的檢測，同時將咳嗽病癥關鍵詞“cough”、哮喘病癥關鍵詞“asthma”為檢索條件輸入，分別在GeneCards數據庫（https://www. genecards.org/）數據庫搜尋相關靶點，以“Relevance score”大于中位數作為標準篩選疾病靶點，獲得疾病相關靶點。

2.9 藥物-疾病靶點預測

搜集得到中藥目標化合物靶點集合與病癥靶點集合后，將成分靶點和疾病靶點相互映射上傳至Draw Veen數據庫取交集，從而獲得交集基因。使用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-疾病”網絡，根據化合物與靶點的連接情況篩選出鮮竹瀝作用于“咳、喘、痰”病的關鍵化合物，并分析成分網絡拓撲參數[17]。

2.10 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析

為進一步研究鮮竹瀝治療咳喘痰的蛋白之間的相互作用，將獲得的藥物-疾病交集基因導入在線STRING 11.0數據庫（https://string-db.org/cgi/input. pl）進行PPI數據庫的構建，物種選擇為人（homo sapiens），隱藏游離節點，將網絡參數以“tsv”格式輸出，將“tsv”文件導入Cytoscape 3.8.0，并對網絡進行分析。用節點大小和顏色反應反映度值的大小，節點越大則表明度值越大；邊的粗細用于反映結合分數的大小，邊越粗則結合分數越大，得到核心靶點的PPI網絡圖。

2.11 功能富集分析與通路富集分析

利用David 6.8數據庫（https://david.ncifcrf. gov/）對交集基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，探討藥物作用的生物學過程，描述基因靶點的功能，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）；對交集基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，探討藥物作用的生物通路，得到潛在靶點所富集的信號通路。GO功能和KEGG通路分析均以＜0.05表示具有統計學意義。

2.12 分子對接實驗

一般而言，在1個網絡中度值越高，它的地位也就越重要，即PPI網絡中度值越大的蛋白在鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥中有重要影響作用。利用AutoDock Vina 1.1.2對鮮竹瀝活性成分和關鍵靶點進行分子對接，驗證其相互作用活性。具體方法如下：

（1）小分子處理：根據CAS號從PubChem數據庫下載3D結構的“SDF”格式小分子，然后導入Chembio3D進行能量最小化導出為mol2格式，導入AutodockTools（v1.5.6）加氫、計算電荷、分配電荷、設置可旋轉鍵后保存為“pdbqt”格式。

（2）蛋白的準備及處理：從PDB（http://www. rcsb. org/）數據庫下載關鍵靶點蛋白（人源蛋白優先，原始配體與要對接的活性成分結構相似度高的優先，選取分辨率高的）；將蛋白倒入PyMoL（2.3.0）去除原始配體和水分子，然后將蛋白導入AutodockTools（v1.5.6）進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。

（3）參數文件的準備：以蛋白原始配體作為對接盒子中心，若無原始配體則將整個蛋白作為對接區域，格點盒子的大小設定為80×80×80（每個格點的間距為0.037 5 nm），其余參數為默認設置。

（4）對接：利用PyMOL和Ligplot進行相互作用模式分析。最后整理分析所得的評分，用以評價小分子化合物與蛋白靶點之間的結合活性。

3 結果及分析

3.1 指紋圖譜相似度評價及結果分析

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）軟件，分別以干餾法和火烤法S8的指紋圖譜作為參照圖譜，采用平均數法，進行多點校正和色譜峰匹配，自動匹配生成指紋圖譜共有模式。相似度評價結果表明，干餾法處理鮮竹瀝的相似度為0.944～0.991，火烤法處理鮮竹瀝的相似度為0.960～0.997，表明同一產地的2種炮制方法制備的8批鮮竹瀝質量較為穩定均一。干餾法及火烤法處理鮮竹瀝的GC-MS指紋圖譜疊加圖見圖1、2，相似度結果見表1。

3.2 鮮竹瀝活性成分篩選及靶點預測

通過比對指紋圖譜鮮竹瀝2種工藝下的物質成分，發現鮮竹瀝指紋圖譜可確定火烤法共15個共有峰，干餾法共51個共有峰。通過“2.6”項下鮮竹瀝成分篩選方法，篩選出14種化合物，其中丁香醛、二氫丁香酚、香草酸、4-乙基愈創木酚、對乙基苯酚、香蘭素僅在干餾法中存在，苯甲酸僅在火烤法中存在，指紋圖譜及其中篩選出的14個成分峰見圖1標示，根據篩選原則篩選出的化合物活性成分信息詳見表2。

圖1 干餾法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜

圖2 火烤法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜

表1 干餾法及火烤法制備的鮮竹瀝GC-MS指紋圖譜相似度

表2 篩選出的鮮竹瀝活性成分的質譜相關參數

3.3 “咳、喘、痰”病癥相關靶點

從SwissTargetPrediction（http://swisstarget- prediction.ch/）網站進行靶點預測，以“Probability”≥0.05作為標準篩選藥物成分靶點，最終得到與候選化合物作用相關的109個靶點蛋白。分別在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）搜尋疾病的相關靶點，以“Relevance score”大于中位數作為標準篩選疾病靶點，總共獲得3162個疾病相關靶點。

3.4 鮮竹瀝“成分-疾病”靶點預測結果

將鮮竹瀝化合物作用靶點與疾病靶點基因取交集（圖3），共獲得鮮竹瀝-疾病交集基因61個，對應鮮竹瀝化合物12個，使用Cytoscape 3.7.2構建鮮竹瀝“成分-靶點”網絡（圖4），網絡中共有165個節點（化合物12個節點、靶點143個節點）；度值較高的化合物有MOL000098（二氫丁香酚）、MOL000422（香草酸）、MOL000358（對乙烯基愈創木酚）、MOL000449（丁香醛）、MOL004561（對乙基苯酚），表明這些化合物可能是鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥的關鍵化合物。

圖3 鮮竹瀝成分-疾病交集基因韋恩圖

圖4 鮮竹瀝“成分-靶點”網絡

3.5 核心靶點及PPI網絡

將韋恩圖得到的成分與疾病的共有靶點導入STRING 11.0數據庫獲得靶點間的相互作用，并以.tsv格式導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網絡圖，之后拓撲分析，以度值反映靶點大小及顏色，以結合分數反映邊的粗細，從而構建網絡[18]，如圖5所示。該網絡共有61個節點和281條邊，網絡平均鄰居節點數為9.21，核心靶點相關參數見表3。

3.6 GO功能與KEGG通路富集分析

在GO功能富集分析中，共獲取281個GO條目，其中BP占187個、MF占64個、CC占30個，BP顯著富集炎癥反應調節、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein，MAP）的調控、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路的反應、炎癥反應等過程；CC主要富集在細胞核、細胞膜及外泌體周圍區域；MF主要富集在Zn離子結合、氧化還原酶活性、類固醇結合等功能，具體信息見表4。鮮竹瀝中化合物主要富集在炎癥反應的調節、MAP酶活性的正向調節、cAMP反應、氧化還原過程、炎癥反應等靶點，提示鮮竹瀝通過多種生物學途徑治療“咳、喘、痰”病癥。

圖5 PPI網絡

表3 核心靶點相關節點參數

KEGG通路富集結果顯示（圖6），61個交集基因顯著富集在36條通路上（＜0.05），選取排名前15位靶基因功能信息。與抗炎抗感染有關的通路為代謝途徑、花生四烯酸代謝、瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道炎性介質調節；與神經興奮有關的通路為羥色胺能突觸、神經活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝；與細胞刺激導致興奮的通路為cAMP信號通路、雌激素信號通路、血管平滑肌收縮；與代謝有關的通路為脂肪細胞中脂解調控、藥物代謝-細胞色素P450；其他通路為缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路。表明這15個核心靶點可能主要通過調控上述通路達到干預疾病的目的。

表4 GO功能富集分析 (top15)

圖6 KEGG通路富集分析(top15)

3.7 分子對接結果

選取8個核心靶點與度值較高的化合物進行半柔性對接（表5），以結合能表示小分子與靶蛋白結合的優劣，結合能小于0代表小分子與靶蛋白可自由結合，結合能越小結合的可能性也就越高[19-20]。分子對接技術僅作為藥物與靶點的結合情況的參考研究，后續將再細化深入。

表5 核心小分子與核心靶蛋白對接結果

本研究選取對接結果較好的化合物香草酸、對乙基苯酚、丁香醛、二氫丁香酚、對乙烯基愈創木酚與金屬基質蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、前列腺素內過氧化物酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）的對接情況進行展示（圖7），對接結果表明小分子均能進入靶蛋白的活性中心，小分子與這2個靶基因的結合能最低，表明小分子與這2個蛋白的結合能力最強；香草醛與MMP9的Arg249形成氫鍵，氫鍵的長度分別為0.288 nm；對乙基苯酚未形成氫鍵，與MMP9的GLU227、Leu188、MET247、Tyr245、His226、Pro246、Tyr248、Va1223殘基形成了較強的疏水作用；丁香醛與PTGS2的Gln461、His39、Arg44 3個殘基分別形成4個氫鍵，氫鍵的長度分別為0.304、0.381、0.308、0.398 nm；二氫丁香酚與His207殘基形成了氫鍵，長度為0.293 nm；對乙烯基愈創木酚對接未形成氫鍵，與MMP9的Glu227、Leu188、Tyr248、Lcu243、Leu222、Tyr245、Val223、Met247、His226形成較強疏水作用。

3.8 鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”的Q-Marker的預測分析

根據經典的2種竹瀝炮制工藝進行制備，先采用指紋圖譜研究其物質基礎，根據鮮竹瀝對“咳喘痰”的治療作用，通過“藥物-靶點-疾病”網絡分析，獲得鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”的關鍵活性成分，并推測潛在治療靶點15個如VEGFA、多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）、細胞色素P450 1B1（cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，CYP1B1）、雌性激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等[19-20]，通過調節花生四烯酸代謝、TRP通道、炎癥反應相關酶抗炎；通過激活cAMP信號通路、雌激素信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、調控MAP激酶活性及cAMP反應控制機體血管平滑肌收縮重構、氧化還原[21-23]等，綜合上述過程，發揮對咳嗽、痰喘病癥的治療作用。預測度值較高的化合物二氫丁香酚、香草酸、對乙烯基愈創木酚、丁香醛、對乙基苯酚可能是鮮竹瀝治療“咳、喘、痰”病癥的關鍵化合物，預測為鮮竹瀝的Q-Marker。其中酚酸類香草酸能夠抑制花生四烯酸誘導的血小板聚集作用，具有抗炎、抗氧化的藥理作用，通過調控脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬細胞中的核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制炎癥[24-25]。丁香醛具有抗氧化、抗炎作用，對心臟有一定的保護作用[26]。二氫丁香酚、對乙烯基愈創木酚及對乙基苯酚為天然酚類抗氧化劑，對清除自由基有重要作用[27]。其中丁香醛、二氫丁香酚、香草酸、對乙基苯酚為干餾法的特有成分。

A-香草酸-MMP9 B-對乙基苯酚-MMP9 C-丁香醛-PTGS2 D-二氫丁香酚-MMP9 E-對乙烯基愈創木酚-MMP9

3.9 Q-Marker的有效性佐證

預測的Q-Marker通過分子對接佐證其生物活性，通過文獻佐證其有效性，通過文獻檢索對鮮竹瀝中的成分的藥效靶向組織、作用、應用見表6。

核心靶點VEGFA可通過調節產生前列環素、增加超氧化物歧化酶的表達等維持和保護肺血管的正常結構，在維持肺臟正常發育和生理功能以及修復損傷方面起著關鍵作用[28-29]。雄性激素受體（androgen receptor，AR）及其受體水平高低可能是其治療慢性支氣管炎的作用機制之一[30-31]。ESR1對ESR1抑癌基因的失活與啟動子病變甲基化有關[32]。同時ESR1、VEGF作為哮喘候選基因可能會導致肺功能下降[33]。DRD2可以減少腫瘤細胞的生長，DRD2的激動劑能以劑量和時間相關性的方式抑制非小細胞肺癌細胞增殖，被認為可能是肺癌患者的潛在治療靶點[34-35]。VEGF能夠通過抑制炎癥及CD133+祖細胞調節保護肺部免受炎癥損傷[36]，通過刺激肺細胞增殖和遷移防止肺細胞死亡，是肺氣腫的肺泡結構恢復劑[37]。PTGS2為前列腺素生物合成中的關鍵酶，與氣道炎癥與慢性阻塞性肺疾病的發病有關[38-39]。MMP9能使白細胞介素-8向中性粒細胞的趨化活性增加，并通過釋放VEGF以參與血管生成，加劇呼吸道纖維化從而氣道重建[40-41]。

表6 鮮竹瀝Q-Marker文獻相關信息

3.10 網絡藥理學分析方法可靠性評價

網絡藥理學為中醫藥學研究新技術和新方法[58]，根據世界中醫藥學會聯合會2021年發布的《網絡藥理學評價方法指南》[59]以及李梢教授團隊發表的“《網絡藥理學評價方法指南》解讀”[60]，對本研究所涉及的網絡藥理學分析方法進行可靠性評價，表明本研究雖預測了鮮竹瀝的Q-Marker，但對成分的有效性缺乏相關體內外實驗驗證；數據來源如相關文獻、各類數據庫收集的數據也尚需擴充，藥物的成分僅由GC-MS檢測，后續還需采用液質儀器、核磁共振等擴充鮮竹瀝的物質基礎庫；針對研究的具體疾病，綜合考慮因素較為簡單，中醫病證與西醫的癥狀不完全等同，存在遺漏個別靶標的可能性；分子對接方法通過簡單的模擬化合物與靶點自由結合能相比較，此結果能為后續的研究提供參考依據，因此后期將繼續對鮮竹瀝的不同炮制方法及其物質基礎進一步擴充，對Q-Marker的“咳、喘、痰”藥效活性及作用機制采用組學、生物芯片等實驗技術方法進一步驗證和闡釋。

4 討論

鮮竹瀝載于《本草綱目》，主治病癥為肺熱咳嗽痰多、氣喘胸悶。其中“咳”用現代藥理解釋為咳嗽，“喘”解釋為喘息、哮喘，“痰”多數表現在氣道的分泌物增多。本研究從Q-Marker的“五原則”出發，采用經典火烤法及干餾法制備鮮竹瀝，GC-MS方法檢測8批鮮竹瀝中的揮發性、小分子成分，獲得鮮竹瀝指紋圖譜并確定火烤法共15個共有峰，干餾法共51個共有峰，并篩選出的14個特征成分峰。以特征成分作為Q-Marker備選成分，通過網絡藥理學預測二氫丁香酚、香草酸、對乙烯基愈創木酚、丁香醛、對乙基苯酚為鮮竹瀝揮發性成分的Q-Marker成分。并用文獻檢索出二氫丁香酚及丁香醛具有較強的抗炎及自由基清除活性；香草酸有抑制氧化應激和預防肺部氣道炎癥有關與肺部腫瘤細胞具有相關性；對乙烯基愈創木酚具有抗氧化、護肝以及改善神經功能有較強的藥理作用；丁香醛具有抑制沙門氏菌的致病力；對乙基苯酚作為酚類成分，具有較強抗炎、抗氧化作用。

核心靶點VEGFA、AR、ESR1、DRD2、VEGF、PTGS2、MMP9、鄰苯二酚--甲基轉移酶（catechol--methyltransferase，COMT）與鮮竹瀝Q-Marker抗炎、神經保護、抗肺部腫瘤等相關，其主要通路為調節炎癥反應、激活cAMP信號通路、調節血管平滑肌收縮、缺氧誘導因子HIF-1信號通路、VEGF信號通路，激活炎癥反應相關酶、cAMP反應。BP主要富集在炎癥反應調節、MAP酶的調控、cAMP的反應、炎癥反應等過程；CC主要富集在細胞核、細胞膜及外泌體周圍區域；MF主要富集在Zn離子結合、氧化還原酶活性、類固醇結合等功能上，核心靶點主要分布于腦、心血管、腫瘤細胞（尤其是肺腫瘤細胞）、肺、肝臟、神經、脾臟、盲腸，并有較高表達量，分子對接則表明Q-Marker與核心靶點有較好的結合能力，理論上表明核心靶點與Q-Marker之間有一定的生物活性。文獻報道及臨床使用鮮竹瀝多用于治療咳、喘、痰，作用多在大腦，肺部、心血管、肝臟，與核心靶點組織分布基本一致，表明核心靶點、通路、Q-Marker具有相關性。

中藥質量是中藥臨床安全有效的基礎，從中藥的治療作用著手，找到影響治療作用的成分，并進行質量控制，體現了Q-Marker的整體觀，為鮮竹瀝質量標準的提升及全程質量控制提供參考[61-62]。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，表明鮮竹瀝的治療是通過多成分、多靶點發揮起效，僅掌握單一成分尚不能全面客觀的評價中藥質量，通過多成分-多靶點網絡藥理學方法得到的成分可以為分析預測鮮竹瀝的Q-Marker提供了有力的證據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of mechanism and quality marker of fresh bamboo sap on “cough, asthma, sputum” based on network pharmacology and molecular docking technology

ZHANG Yu-tian1, 2, WU Zhen-feng1, HUANG Yi3, ZHANG Jun4, ZHANG Xun1, LIN rui-hua1, WAN Na3, YANG Ming1

1. Key Laboratory of Modern Preparations of Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 3. School of Pharmacy, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 4. The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China

To predict and analyze the mechanism and potential quality marker (Q-Marker) of fresh bamboo sap in the treatment of “cough, asthma, sputum” based on network pharmacology and molecular docking methods.Fresh bamboo sap was prepared by dry distillation and fire roasting. The fingerprint of fresh bamboo sap was studied, and the potential targets and pathways of 14 components were screened and predicted. Target genes of “cough, asthma, sputum” disease were determined by combining literature database. Intersection genes of drug and disease were taken, protein-protein interaction (PPI) analysis was performed by String database, gene ontology (GO) functions and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on intersection genes were performed by clusterProfiler function of Rstudio. Q-Markers of fresh bamboo sap were predicted, and molecular docking software was used to perform molecular docking on key targets and its corresponding components to verify the network analysis results.Eight batches of main active ingredients of fresh bamboo sap which prepared by dry distillation and fire roasting were obtained by fingerprint study. The therapeutic effects of fresh bamboo sap on “cough, asthma, sputum” symptoms were analyzed by network pharmacology and molecular docking. Q-Markers were vanillic acid,-ethylphenol, syringaldehyde, dihydroeugenol and-vinylguaiacol, which mainly regulated inflammation, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway, hypoxia-inducible factor hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) signaling pathway, vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway and other important biological pathways to play the role of relieving cough, asthma and phlegm.By predicting the Q-Markers of fresh bamboo sap, it has laid a research foundation for improving its quality control standards, and provides a reference for study of related substances of fresh bamboo sap and explanation of mechanism. It provides a reference basis for its secondary development and the potential to expand the scope of clinical use.

fresh bamboo sap; network pharmacology; quality marker; molecular docking; relieving cough; resolving phlegm; relieving asthma; vanillic acid;-ethylphenol; syringaldehyde; dihydroeugenol;-vinylguaiacol

R285

A

0253 - 2670(2021)24 - 7538 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.016

2021-08-05

國家重點研發計劃項目（2018YFC1707203）；江西省科學技術協會項目（贛科協字[2018]117號）；國家級大學生創新創業計劃項目（202010412011）；江西省中醫藥管理局科技計劃項目（2019A031）；江西省教育廳科學研究青年項目（GJJ180692）

張雨恬（1990—），女，博士，研究方向為中藥藥劑及中藥質量分析研究。Tel: (0791)87118658 E-mail: rainyzyt@163.com

萬 娜，講師，從事中藥新劑型與新技術研究。E-mail: wanna988@163.com

楊 明，博士生導師，教授，從事中藥藥劑及炮制技術研究。E-mail: lab215@163.com

[責任編輯 李亞楠]