UPLC-Q-TOF-MS聯用研究不同廠家前列癃閉通片指紋圖譜

崔 璐，褚 征，康廷國，趙慶春，康 燁*

UPLC-Q-TOF-MS聯用研究不同廠家前列癃閉通片指紋圖譜

崔 璐1，褚 征1，康廷國2，趙慶春1，康 燁1*

1. 北部戰區總醫院，遼寧 沈陽 110023 2. 遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600

通過建立前列癃閉通片（Qianlielong Bitong Tablets，QBT）的UPLC指紋圖譜，考察了9個廠家58批次QBT的質量，為完善該制劑的質量控制奠定基礎。采用UPLC法，色譜柱Eclipse Plus C18RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，采用全時段多波長融合技術，體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃。建立QBT的指紋圖譜，并對各樣品的指紋圖譜進行相似度評價，結合聚類分析評價58批樣品的質量，指認了指紋圖譜中主要共有峰的化學成分并確定了其藥材歸屬。首次建立QBT的UPLC指紋圖譜，對其中16個共有峰進行了化學成分鑒定，分別是辛弗林（1號峰）、虎杖苷（2號峰）、金絲桃苷（3號峰）、新圣草苷（4號峰）、柚皮苷（5號峰）、橙皮苷（6號峰）、新橙皮苷（7號峰）、枸橘苷（8號峰）、朝藿定A（9號峰）、朝藿定B（10號峰）、朝藿定C（11號峰）、淫羊藿苷（12號峰）、芒柄花素（13號峰）、寶藿苷（14號峰）、大黃素（15號峰）、大黃素甲醚（16號峰），確定了16個特征峰來源于方中4味中藥，峰1、4～8歸屬枳殼藥材，峰2、3、15、16歸屬虎杖藥材，峰9～12、14歸屬淫羊藿藥材，峰13歸屬黃芪藥材。對9個生產企業58批次樣品進行相似度評價，相似度分布在0.600～0.912，通過聚類分析大致可聚為4類。建立QBT的指紋圖譜，該方法簡便、可靠，為進一步評價和監測QBT的質量提供參考。

UPLC-Q-TOF-MS；前列癃閉通片；質量評價；指紋圖譜；相似度；聚類分析；全時段多波長融合技術；辛弗林；虎杖苷；金絲桃苷；新圣草苷；柚皮苷；橙皮苷；枸橘苷；朝藿定；淫羊藿苷；芒柄花素；寶藿苷；大黃素；枳殼；虎杖；淫羊藿；黃芪

前列癃閉通片（Qianlielong Bitong Tablets，QBT）收載于《國家中成藥標準匯編》內科腎系分冊，是在復方前列癃閉膠囊的基礎上改劑型而成的現代中藥制劑。本方以黃芪為君藥，桂枝、土鱉蟲、冬葵果、桃仁、淫羊藿為臣藥，柴胡、茯苓、枳殼、虎杖、川牛膝為佐藥，共11味藥材經水煎煮、濃縮等工藝精制而成，具有益氣溫陽、活血利水的功效，臨床用于治療腎虛血瘀所致的癃閉，癥見尿頻、排尿延緩、費力、尿后余瀝、腰膝酸軟，亦可用于具有上述癥候的慢性前列腺炎[1-2]和良性前列腺增生[3-4]的患者。

目前全國有11家生產企業生產QBT，生產企業較多且無統一標準，雖各生產企業的處方以及生產工藝相同，但是各生產企業的藥品質量有較大差別，可能是受到原料藥來源、生產工藝參數等眾多因素影響。為了評價該藥質量的一致性，并最大限度地表征QBT的特征成分，本實驗以抽檢的9個生產企業共58批不同批號的QBT為對象，首次建立其UPLC指紋圖譜，并對指紋圖譜中的主要特征峰進行化學成分的指認，以及組方中藥來源的初步確定。通過計算相似度和聚類分析，對各生產企業各批次樣品進行質量評價，為完善QBT的質量控制奠定基礎，保證該藥的臨床療效。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent 6550精確質量四極桿飛行時間（Q-TOF）LC/MS系統，美國安捷倫公司；HS6150型超聲波清洗器，天津恒奧科技發展有限公司；Milli-Q超純水處理裝置，美國Millipore公司；Sartorius CP225D型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 試藥與試劑

對照品辛弗林（批號110727-201107）、虎杖苷（批號111575-200502）、金絲桃苷（批號111521-201406）、柚皮苷（批號110722-201312）、橙皮苷（批號110721-201316）、新橙皮苷（批號111857-201102）、朝藿定C（批號111780-201302）、淫羊藿苷（批號110737-200415）、芒柄花素（批號111703-200603）、寶藿苷（批號111852-201102）、大黃素（批號110756-200110）、大黃素甲醚（批號110758-201013）均購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均≥98%；對照品朝藿定A（批號GZDD-0477）、朝藿定B（批號GZDD-0478）均購自貴州迪大生物科技有限責任公司，質量分數均≥98%；對照品新圣草苷（批號A0032）購于成都曼斯特生物有限公司，質量分數≥98%；對照品枸橘苷（批號p114052）購于Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司，質量分數≥98%。

藥材黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根（批號120974-201311）、虎杖為蓼科虎杖屬植物虎杖Sieb. et Zucc.的干燥根莖和根（批號120980-201005）、桃仁為薔薇科桃屬植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子（批號120953-201106）、川牛膝為莧科杯莧屬植物川牛膝Kuan的干燥根（批號121065-201105）、枳殼為蕓香科植物酸橙L.的干燥未成熟果實（批號120981-201104）、桂枝為樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥嫩枝（批號121191- 201304）、茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核（批號121117- 201308）、柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡DC.的干燥根（批號120992-201108）、淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Maxim.的干燥葉（批號121632-201101）、土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉Walker的雌蟲干燥體（批號121533-200702），均購自中國食品藥品檢定研究院；冬葵果采摘于本溪懷仁縣，為錦葵科甜菜屬植物冬葵L. 的干燥成熟果實；以上藥材均由遼寧省檢驗檢測認證中心中藥室王維寧主任中藥師鑒定。

供試品覆蓋全國26個省共9個生產企業的58批QBT，分別是吉林百琦藥業有限公司（BQ）、長春新安藥業有限公司（CC）、吉林吉爾吉藥業有限公司（JEJ）、沈陽神龍藥業有限公司（SL）、陜西華西制藥有限公司（SX）、武漢健民藥業集團股份有限公司（WH）、江蘇萬高藥業有限公司（WG）、藥圣堂（湖南）制藥有限公司（YST）、江蘇頤海藥業有限公司（YH），見表1。

表1 QBT樣品的信息

乙腈，質譜級，德國默克集團；甲醇，色譜級，Fisher公司；甲酸，質譜級，賽默飛世爾公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取QBT 20片，除去薄膜衣，稱定質量，研細，取0.5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇溶液25 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W、頻率50 kHz）45 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 取辛弗林、金絲桃苷、虎杖苷、新圣草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、芒柄花素、寶藿苷、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，加50%甲醇溶液1 mL，超聲10 min，濾過，即得混合對照品溶液。

2.1.3 各藥材供試溶液的制備 取黃芪、土鱉蟲、冬葵果、虎杖、枳殼、柴胡、川牛膝、桂枝、淫羊藿、桃仁、茯苓藥材粉末，分別按照其在處方中的投料量折算后取樣，按“2.1.1”項下方法制備，作為各原料藥材對照溶液。

2.2 UPLC色譜條件

色譜柱為Eclipse Plus C18RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，2%乙腈；5～9 min，2%～10%乙腈；9～12 min，10%～15%乙腈；12～19 min，15%乙腈；19～30 min，15%～26%乙腈；30～36 min，26%～36%乙腈；36～43 min，36%～50%乙腈；43～48 min，50%～80%乙腈；48～49 min，80%～95%乙腈；49～51 min，95%乙腈；檢測波長248、270、283、290、306 nm，體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量3.5 μL。理論板數按淫羊藿苷色譜峰計算應不低于1500。

2.3 MS分析條件

2.3.1 一級質譜條件 電噴霧離子源，采用正離子模式檢測，干燥氣體體積流量為11 L/min，干燥氣體溫度為250 ℃，毛細管電壓為4000 V，霧化器壓力為0.30 MPa，碎裂電壓為365 V，質量掃描范圍為/100～1500。

2.3.2 二級質譜條件 電噴霧離子源，正離子模式檢測，干燥氣體氣溫為325 ℃，干燥氣體體積流量為6 L/min，霧化器壓力0.30 MPa，鞘氣氣體溫度400 ℃，鞘氣氣體體積流量為12 L/min，毛細管電壓4000 V，Q-TOF碎裂電壓365 V，質量掃描范圍/50～2500。

2.4 全時段多波長指紋圖譜融合方法

采用DAD二極管陣列檢測器對QBT在200～400 nm對混合對照品進行掃描，選擇能夠滿足所有活性成分的峰面積最大值，經過掃描得到波長確定為248、270、283、290、306 nm。根據文獻采用全時段多波長融合技術[5]，分別從Agilent 1290色譜工作站中導出248、270、283、290、306 nm的dif格式數據文件，使用Matlab軟件編程，對dif格式數據進行全時段多波長融合，得到同時反映5個波長信息的色譜圖。

2.5 指紋圖譜方法學考察

根據上述“2.2”項下方法對9個生產企業58批次QBT進行測定，并對其精密度、穩定性、重復性進行考察。以相對獨立的12號峰（淫羊藿苷）作為參比峰，對其他峰的相對保留時間和相對峰面積進行計算。

2.5.1 精密度考察 取BQ-D樣品按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，測定并記錄色譜圖，以12號峰為參照峰，該峰為所有樣品共有且峰面積較大、分離較好，考察各主要色譜峰與參比峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，計算相應RSD值，各色譜峰的相對保留時間的RSD＜1.0%，相對峰面積的RSD＜3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性考察 取BQ-D供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別在供試品溶液制備后的0、2、4、6、12、24 h重復進樣6次，結果各共有峰相對保留時間的RSD在0.03%～0.67%，相對峰面積的RSD在0.29%～3.33%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.3 重復性考察 按“2.1.1”項下方法制備6份BQ-D供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定。結果各共有峰相對保留時間的RSD在0.30%～2.30%，相對峰面積的RSD在0.30%～2.81%，說明方法重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立及相似度的計算

將58批QBT樣品按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.2”項下色譜條件進行測定，結果16個峰為QBT的共有峰，且這些峰的峰面積總和占總峰面積的90%以上。對所得出的58批樣品指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A版”進行分析，9個生產企業樣品的指紋圖譜以BQ-D樣品圖譜作為相似度計算校正的參照譜，采用中位數法生成對照圖譜（R），各廠家部分代表性批次樣品的指紋圖譜見圖1，計算各廠家各批次與對照指紋圖譜的相似度，結果見表2。

圖1 58批次QBT UPLC指紋圖譜

表2 各樣品UPLC指紋圖譜的相似度

2.7 QBT共有峰確認和歸屬

2.7.1 指紋圖譜藥材歸屬分析 根據QBT的生產工藝，將處方中的11味藥材均經水煎，濃縮。再分別根據“2.1.3”項各藥材對照品溶液制備方法制備，按“2.2”項下色譜條件測定。根據紫外光譜信息，對全方與藥材指紋圖譜中的相關峰進行歸屬，確認峰1、4～8歸屬枳殼藥材，峰2、3、15、16歸屬虎杖藥材，峰9～12、14歸屬淫羊藿藥材，峰13歸屬黃芪藥材（圖2）。其余原料藥材的色譜圖在此檢測條件下信息量較少，有待進一步研究。

2.7.2 對照品法指認各共有峰 取“2.1.2”混合對照品進樣，按“2.2”項下色譜條件測定。結果見圖2。通過與樣品色譜圖比較對照品的保留時間并掃描對比其紫外吸收光譜，從而初步猜測1號峰為辛弗林，2號峰為虎杖苷，3號峰為金絲桃苷，4號峰為新圣草苷，5號峰為柚皮苷，6號峰為橙皮苷，7號峰為新橙皮苷，8號峰枸橘苷，9號峰為朝藿定A，10號峰為朝藿定B，11號峰為朝藿定C，12號峰為淫羊藿苷，13號峰為芒柄花素，14號峰為寶藿苷I，15號峰為大黃素，16號峰為大黃素甲醚。

1-辛弗林 2-虎杖苷 3-金絲桃苷 4-新圣草苷 5-柚皮苷 6-橙皮苷 7-新橙皮苷 8-枸橘苷 9-朝藿定A 10-朝藿定B 11-朝藿定C 12-淫羊藿苷 13-芒柄花素 14-寶藿苷I 15-大黃素 16-大黃素甲醚

2.7.3 UPLC-Q-TOF-MS指認各色譜峰 為進一步闡明QBT指紋圖譜表征的化學成分，采用UPLC-Q- TOF-MS技術對色譜峰進行確認。由于QBT的處方藥味多，化學成分差別較大，故同時采用正、負離子模式進行掃描見圖3，從圖3中可以看出負離子流圖離子峰較少，正離子流圖都能涵蓋，所以最終采用正離子模式。通過質譜中分子離子峰和碎片離子峰的信息，結合紫外吸收光譜特征，與相關文獻報道以及對照品進行對照，鑒定了QBT指紋圖譜中16個色譜峰，結果見表3。

圖3 QBT樣品的總離子流圖

表3 QBT的UPLC-MS分析結果

2.8 樣品數據聚類分析

將各生產企業QBT樣品指紋圖譜的16個共有峰相對于參照峰12號，采用SPSS 19.0軟件對所有QBT樣品進行系統聚類分析。采用組間連接法，利用平方Euclidean距離（squared Euclidean distance）為測度，計算不同樣品間相似程度，結果見圖4。

圖4 QBT的聚類分析圖

聚類分析將不同廠家的樣品大致分為4類：一類包括生產企業為BQ、SL、SX、YST的樣品，其相似度較高，一般大于0.8；二類包括生產企業WG、WH、CC、YH的樣品，該類相似度相對較低在0.6～0.7；三類包括生產企業JEJ、CC的樣品，該類樣品相似度不高且較分散，質量差異性較大；四類包括生產企業有WH、WG、SL、BQ、SX的個別的樣品，該類為個別生產企業相似度較低的分為這一組。WG、WH、CC的各批次樣品較分散，表明這些企業的生產工藝不是十分穩定。同廠家的樣品基本聚在同一類中，也有個別的生產企業分為幾類，分類基本與不同的生產批號一致。聚類分析得到的樣品之間的相關性，與相似度計算得到的樣品之間的相關性，結果較一致。聚類分析更能直觀地看出各生產企業之間的區別。

3 討論

3.1 實驗條件的選擇

本實驗比較了回流和超聲2種提取方法；提取溶劑考察了50%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇5種提取溶劑；溶劑用量考察了25、50 mL；以及超聲時間15、30、45、60 min進行了考察，結果表明采用25 mL 50%甲醇超聲處理45 min即可完全提取。分別考察了甲醇-水系統，乙腈-水系統，乙腈-0.1%甲酸水，乙腈-0.5%甲酸水4個溶液系統，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水系統。指紋圖譜的檢測波長選用248、270、283、290、306 nm 5個波長進行全時段融合。

3.2 相似度及聚類分析

對所測9個生產企業樣品的UPLC指紋圖譜進行比較，實驗結果表明，指紋圖譜相似度結果與聚類分析的結果基本一致。BQ、SL、SX、YST 4個生產企業樣品相似度較高，質量一致性較好；WG、WH、CC 3個生產企業樣品指紋圖譜的相似度較分散，主要考慮與樣品的生產工藝參數不穩定或原料藥材的質量穩定性相關，導致生產批號較遠的樣品質量差異明顯。而另有JEJ、YH生產企業樣品指紋圖譜的相似度低也有分散，與其他廠家的樣品指紋圖譜比較發現，其色譜圖中來源于枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷的含量較低。

3.3 化學成分指認分析

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS技術對QBT進行定性的分析。通過對一級、二級質譜中分子離子峰和碎片離子峰的信息進行分析，結合紫外吸收光譜特征，并與相關文獻報道[6-11]以及對照品進行對照，鑒定出了QBT指紋圖譜中16個色譜峰。如總離子流色譜圖中的6號峰橙皮苷（R＝19.039 min）和7號峰新橙皮苷（R＝21.182 min）在正離子模式下顯示出相同的準分子離子峰/633.2 [M＋Na]+峰，二級質譜均產生/487.1離子，應該為黃酮類苷元[Y1＋Na]+碎片離子峰，/331.1離子，應該為[B2＋Na]+碎片離子峰，但是7號峰新橙皮苷還存在/179.1離子，應該為[A0＋H2＋H]+碎片離子峰，通過結合對照品對比以及查閱相關文獻報道[9]，故確認6號峰為橙皮苷，7號峰為新橙皮苷。用類似方法其余14個色譜峰經UPLC-Q-TOF-MS分析均與對照品的質譜裂解規律一致，并且化學物質組主要包含4類有效組分，分別為①黃酮類化合物：1、4～14號峰依次為辛弗林、新圣草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、芒柄花素、寶藿苷；②二苯乙烯化合物：2號峰虎杖苷；③黃酮醇苷類：3號峰金絲桃苷；④蒽醌類化合物：15號峰大黃素和16號峰大黃素甲醚。QBT的有效成分以黃酮類化合物為主要成分。

綜上所述，本實驗以QBT為研究對象，首次建立其UPLC指紋圖譜，指認了其中16個峰的化學成分，并確定了這16個化學成分的歸屬藥材。將建立的指紋圖譜應用于9個生產廠家58批次樣品的質量評價，通過相似度計算，發現不同廠家QBT的質量差異較大，現行標準的質量控制內容難以保證臨床療效穩定，而UPLC指紋圖譜[12-15]更全面表征不同廠家藥品的質量信息，較常規檢驗和單個成分定量測定，更能全面反映該制劑質量的一致性和穩定性[16-18]，對QBT的質量比較與評價有更積極的意義，為保證臨床用藥的安全性、有效性和穩定性提供了方法和依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Fingerprint of Qianlie Longbitong Tablets from different manufacturers by UPLC-Q-TOF-MS

CUI Lu1, CHU Zheng1, KANG Ting-guo2, ZHAO Qing-chun1, KANG Ye1

1. General Hospital of Northern Theater Command, Shenyang 110032, China 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

To establish an UPLC fingerprint of Qianlielong Bitong Tablets (前列癃閉通片, QBT) for quality evaluation of 58 batches of QBT from nine different manufacturers, so as to support the foundation of quality control system of the tablets.The method was performed by UPLC with Eclipse Plus C18RRHD (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) column; acetonitrile-0.1% formic acid aqueous as the mobile phase for gradient elution, with the all-time multi-wavelength fusion. The flow rate was 0.3 mL/min, column temperature was 30℃. The HPLC fingerprint was established and evaluated by the similarity evaluation system of QBT, the quality of 58 batches of samples was evaluated by cluster analysis. The chemical constituents of the main common peaks were identified in the fingerprint and attributed to raw materials.The UPLC fingerprint of QBT was developed firstly, the chemical constituents of 16 common peaks were identified, including synephrine (peak 1), polydatin (peak 2), hyperoside (peak 3), neoeriocitrin (peak 4), naringin (peak 5), hesperidin (peak 6), neohesperidin (peak 7), poncirin (peak 8), epimedin A (peak 9), epimedin B (peak 10), epimedin C (peak 11), icariin (peak 12), formononetin (peak 13), baohuoside (peak 14), emodin (peak 15), physcion (peak 16), and the 16 characteristic peaks were determined from four traditional Chinese medicines. The peaks 1, 4—8 were attributed to Zhiqiao (), the peaks 2, 3, 15, 16to Huzhang (et), the peaks 9—12, 14to Yinyanghuo (), the peak 13to Huangqi (). The analyzed samples were geographically classified into four classes with the similarities between 0.600—0.912.The fingerprint of QBT was developed, the method is simple and reliable. It provides reference for further evaluation and monitoring the quality of QBT.

UPLC-Q-TOF-MS; Qianlielong Bitong Tablets; quality evaluation; fingerprint; similarity; cluster analysis; all-time multi-wavelength fusion; synephrine; polydatin; hyperoside; neoeriocitrin; naringin; hesperidin; poncirin; epimedin; icariin; formononetin; baohuoside; emodin;;et;;

R286.02

A

0253 - 2670(2021)24- 7493 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.011

2021-06-28

崔 璐，女，碩士，主管中藥師，研究方向中藥鑒定與品質評價。E-mail: 1031706465@qq.com

康 燁，女，碩士，主管藥師，研究方向臨床藥理。E-mail: liushixun0822@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]