一測多評法同時測定生脈注射液中12個成分

李佳寅，張小平，方夢婷，張子雯，葉春穎，姬翔宇，魏真真，詹淑玉*

一測多評法同時測定生脈注射液中12個成分

李佳寅1，張小平1，方夢婷2，張子雯2，葉春穎2，姬翔宇2，魏真真2，詹淑玉2*

1. 嘉興學院附屬醫院 心內科，浙江 嘉興 314001 2. 嘉興學院醫學院，浙江 嘉興 314001

建立同時測定生脈注射液中12個成分含量的一測多評（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS）方法。采用HPLC法，以人參皂苷Rb1為參照物，建立其它11個成分人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的相對校正因子（f/s），并對f/s進行耐用性考察。采用外標法和QAMS法測定生脈注射液中12個成分含量，比較兩者的差異，驗證QAMS法的可行性和準確性。各個成分的f/s重復性良好，對14份生脈注射液樣品運用QAMS法和外標法得到的各成分含量無顯著性差異（RSD＜3%）；不同廠家、不同批號之間的成分含量差異較大。14份樣品中12個成分人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的質量濃度分別為83.3～141.9、85.9～183.2、34.6～64.4、137.0～316.4、47.2～99.1、84.6～235.0、60.9～147.9、9.5～28.7、32.2～117.2、17.4～34.7、9.8～23.9和2.0～8.7 μg/mL。所建立的QAMS法準確性高，可用于生脈注射液多成分的同時定量分析，為生脈注射液的全面質量控制提供方法參考。

生脈注射液；一測多評；人參皂苷；五味子醇甲；五味子醇乙；質量控制

生脈注射液（Shengmai Injection，SMI）是由紅參、麥冬和五味子3味中藥組成的復方制劑，在臨床上廣泛用于治療心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等癥，也用于其它如抗肺疾病[1]、癌癥化療[2]等的輔助治療。SMI是一種確有療效的中藥復方注射劑，為中藥保護品種，入選《國家基本藥物目錄》，也是近期國家衛生健康委提出的治療新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的中成藥之一[3]。

中藥復方多成分的定性、定量分析是中藥質量控制的基礎，也是開展中藥基礎研究的重要內容。目前對于SMI的定性分析研究已經廣泛開展[4-5]，然而對于其多成分的定量研究還很有限，現有方法主要基于HPLC/UPLC，采用常規外標法測定了SMI中少數幾個含量較高、對照品易得且價廉的人參皂苷及木脂素類成分[6-9]，但由于中藥多成分的復雜性，現有研究還無法用于全面控制SMI的質量，特別是對于一些缺乏對照品或對照品難以獲取、價格昂貴的成分，對其進行定量分析還存在一定困難。因此，迫切需要開發和應用新的技術方法以幫助提高SMI的質量控制水平。

一測多評（quantitative analysis of multi- components with a single-marker，QAMS）是近年來在中藥研究領域內普遍認可、應用較廣泛的中藥質量控制模式，它是利用中藥各有效成分內在函數關系（相對校對因子），可以通過只測定某一典型組分的含量，來實現多指標成分的同步測定[10]。目前在中藥質量控制中QAMS的研究方法體系日益完善，其應用范圍不斷擴大[11-17]，但基于QAMS法的SMI多指標成分同時分析的研究還未見報道。本研究采用QAMS法對SMI多成分進行定量分析，以含量高、價廉易得的人參皂苷Rb1（Rb1）為參照物，求算SMI中其它11種成分人參皂苷Rg1（Rg1）、Re、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3、五味子醇甲和五味子醇乙的相對校正因子（f/s），并對f/s進行耐用性考察。最后基于QAMS法對來自不同廠家、不同批號的多批次SMI進行12種成分的含量測定，并與外標法的結果進行比較，證明QAMS法的可行性。本研究首次采用QAMS法開展SMI的多指標定量分析，以期為SMI的全面質量控制提供技術手段和科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；，Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；XS105DU型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；HC-1014型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；超純水機，Millipore SAS 67120 Molsheim France。

1.2 試藥

對照品Rg1（批號8797，質量分數98.0%）、人參皂苷Re（Re，批號5121，質量分數98.6%）、人參皂苷Rf（Rf，批號7880，質量分數99.0%）、人參皂苷Rh1（Rh1，批號3148，質量分數98.5%）、人參皂苷Rc（Rc，批號8180，質量分數99.0%）、人參皂苷Rb2（Rb2，批號2761，質量分數98.3%）、人參皂苷Rb3（Rb3，批號8886，質量分數98.2%）、人參皂苷Rd（Rd，批號4899，質量分數98.7%）、人參皂苷20()-Rg3（20()-Rg3，批號6604，質量分數98.5%）、五味子醇甲（批號2329，質量分數99.0%）和五味子醇乙（批號3249，質量分數98.3%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；對照品Rb1（批號110704-202029，質量分數99.0%）由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈，色譜純，河北百靈威超精細材料有限公司；醋酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為超純水。收集來自2個廠家、不同批次以及勾兌處理后的共14份SMI進行含量測定，樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.02%醋酸水溶液（A）- 0.02%醋酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～20 min，20%～22% B；20～30 min，22%～24% B；30～45 min，24%～28% B；45～70 min，28%～42% B；70～90 min，42%～58% B；90～105 min，58%～69% B；105～115 min，69%～73% B；115～125 min，73%～87% B；125～126 min，87%～20% B，平衡20 min；體積流量0.8 mL /min；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，色譜圖見圖1。

表1 SMI樣品信息

2.2 單一對照品儲備液的制備

精密稱取Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為4.11、3.92、1.15、4.00、1.21、1.15、1.14、4.10、1.21、1.26、1.14、1.14 mg/mL的單一對照品儲備液，并于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取SMI或勾兌處理后的樣品適量，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下各對照品儲備液適量混合，加80%甲醇制成Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙質量濃度分別為328.8、301.8、283.0、392.0、298.9、136.1、228.3、411.6、196.1、132.3、32.2、28.5 μg/mL的混合對照品溶液，并采用80%甲醇逐級稀釋，制得系列質量濃度的混合對照品溶液，稀釋倍數依次為1.25、2、2、2、2、2.5倍，按“2.1”項色譜條件測定。以對照品質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，進行線性回歸，計算回歸方程以及相關系數（2）。根據信噪比（/）3和10分別確定12個成分的檢測限和定量限。結果（表2）表明，12個成分在相應的質量濃度范圍內線性關系良好。

1-Rg1 2-Re 3-Rf 4-Rb1 5-Rh1 6-Rc 7-Rb2 8-Rb3 9-Rd 10-五味子醇甲 11-20(S)-Rg3 12-五味子醇乙

表2 12個成分的線性回歸方程、檢測限和定量限

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次20 μL，記錄峰面積，計算RSD值。結果12個成分Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙峰面積的RSD分別為0.23%、2.05%、2.73%、0.58%、1.83%、2.05%、2.81%、1.89%、0.94%、2.23%、0.41%、2.78%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密吸取同一批號的SMI（S1）6份，按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，制作隨行標準曲線求算6份樣品的平均質量濃度及RSD值。結果12個成分Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的平均質量濃度分別為113.5、185.7、64.8、286.3、64.0、227.8、145.7、28.2、114.1、34.5、13.8、8.5 μg/mL，RSD值分別為2.02%、2.22%、2.68%、1.33%、1.75%、0.95%、0.92%、2.81%、1.41%、1.17%、1.15%、1.10%，表明方法的重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1）適量，分別于0、2.5、5、7.5、8、15、24 h以“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各個測定時間點的峰面積，計算RSD值。結果12種成分Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙峰面積的RSD分別為1.19%、1.82%、2.31%、0.97%、1.85%、2.06%、2.90%、2.45%、0.91%、3.00%、2.53%、2.83%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密吸取已測定各成分含量的同一批號SMI（S1）6份，各精密加入Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙質量濃度分別為111.0、203.8、73.6、232.0、79.9、293.3、159.6、16.4、154.9、40.3、19.4、11.4 μg/mL的混合對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定各成分質量濃度，并計算加樣回收率和RSD值。結果12種成分Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的平均加樣回收率分別為102.4%、100.3%、96.8%、101.1%、101.1%、102.9%、101.0%、101.0%、101.0%、100.9%、105.1%、104.9%，RSD分別為3.71%、3.00%、2.19%、2.28%、2.22%、1.97%、2.23%、4.09%、4.06%、3.50%、2.57%、2.01%。

2.5 fk/s測定

精密吸取混合對照品溶液10、12、15、20、25、28、30 μL，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各成分峰面積，以Rb1為參照物，分別計算Rg1、Re、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的f/s（表3）。

f/s＝f/s＝CAs/sA

C為待測成分質量濃度，A為待測成分峰面積，s為參照物質量濃度，s為參照物峰面積

表3 各成分的fk/s

2.6 fk/s的耐用性考察

2.6.1 不同儀器和不同色譜柱對f/s的影響 分別考察了Agilent 1260和Thermo Fisher UltiMate 3000（UltiMate 3000）2臺高效液相色譜儀及Agilent Zorbax EclipseXDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3根色譜柱對f/s的影響，結果在不同儀器和不同色譜柱下各成分f/s的RSD值均小于5%（表4），表明更換儀器或色譜柱對各成分的f/s無顯著影響，適用性良好。

2.6.2 不同體積流量對f/s的影響 考察了3個體積流量（0.8、0.9、1.0 mL/min）對f/s的影響，結果不同體積流量下各成分f/s的RSD均小于3%（表5），表明體積流量的波動對各成分f/s無顯著影響。

2.6.3 不同柱溫對f/s的影響 考察了5個柱溫（25、28、30、32、35 ℃）對f/s的影響，結果不同柱溫下各成分f/s的RSD均小于3%（表6），表明不同柱溫對各成分f/s無顯著影響。

2.7 待測成分色譜峰定位

本研究考察了采用不同儀器和不同色譜柱時，Rg1、Re、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3、五味子醇甲、五味子醇乙和參照物Rb1的相對保留時間，對各待測成分進行色譜峰定位，結果各成分相對保留時間的RSD均小于5%（表7），表明可利用相對保留時間對各成分進行定位。

2.8 QAMS法與外標法測定結果比較

對表1來自不同廠家、不同批號和勾兌處理的14份樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，分別采用外標法、QAMS法計算含量，每種樣品平行測定3份，求算平均含量。將QAMS法與外標法測定的含量采用RSD進行比較，結果14種樣品中12個成分的RSD均小于3%（表8），表明2種方法含量測定結果無明顯差異。

表4 不同儀器、不同色譜柱對fk/s的影響

表5 不同體積流量對fk/s的影響

表6 不同柱溫對fk/s的影響

表7 不同儀器、不同色譜柱對相對保留時間的影響

3 討論

3.1 色譜條件的優化

SMI是由3味中藥組成的復方制劑，成分復雜，特別是其中人參皂苷的種類較多。為了使多成分達到較好的分離效果，對流動相的組成進行了考察，比較了甲醇-水、乙腈-水和添加不同比例酸（甲酸、醋酸或磷酸）對梯度洗脫的分離效果，結果顯示在有機相和水相中分別添加0.02%醋酸可以提高分離度、改善峰形；另外，對流動相比例梯度進行精細優化，綜合考慮體積流量、分析時間和樣品成分的復雜性，最終確定了在體積流量為0.8 mL/min條件下的最優梯度洗脫條件，該條件下12種成分在100 min內分離效果良好。

表8 外標法和QAMS法檢測結果比較

3.2 指標成分和參照物的選擇

多數研究表明，SMI的主要物質組成包括來自紅參的人參皂苷類成分和來自五味子的木脂素類成分，這些成分構成SMI的藥效物質基礎[18-19]。因此，本研究選擇了活性明確、含量較高的代表性成分作為SMI質量控制的指標性成分進行QAMS法的含量測定，主要包括二醇型人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3，三醇型人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1以及木脂素成分五味子醇甲和五味子醇乙。

從含量測定結果看，Rb1在12個成分中含量最高，與其它成分分開明顯，在譜圖中最易識別，其保留時間約為72 min，處于色譜圖的中位，利于其它成分色譜峰的相對保留時間計算和色譜峰的識別，而且Rb1性質穩定、價廉易得，因此，本研究選擇Rb1作為參照物，其符合QAMS法中參照物選擇的基本要求。

3.3 QAMS法的準確性及含量測定結果

本研究在不同品牌儀器和色譜柱、不同柱溫、不同體積流量等條件下考察了QAMS方法的重現性，并通過對不同廠家、不同批次和勾兌處理的SMI的12個成分進行了含量測定，結果QAMS法計算的含量結果與外標法無顯著性差異，證明了QAMS法的準確性。含量測定結果發現，14份樣品中11個成分人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20()-Rg3及五味子醇甲和五味子醇乙的質量濃度分別為83.3～141.9、85.9～183.2、34.6～64.4、137.0～316.4、47.2～99.1、84.6～235.0、60.9～147.9、9.5～28.7、32.2～117.2、17.4～34.7、9.8～23.9、2.0～8.7 μg/mL，不同廠家、不同批號SMI中12種成分含量存在較大差異，這種差異可能與藥材來源和質量、生產過程和工藝控制水平等諸多因素有關，因此，還應提高SMI的質量控制標準。

SMI中化學成分眾多，以外標法測定各成分含量需要對照品的數量多，部分對照品價格昂貴且難以獲取，采用QAMS法測定各成分含量，能極大地減少對照品使用數量，節約成本，使SMI多成分的同時檢測更加便利、可行。本研究以Rb1為參照物，可以在缺少其他對照品的情況下，通過f/s計算多種成分的含量，為SMI的全面質量控制提供了新的方法參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Simultaneous quantitative determination of 12 components in Shengmai Injection by QAMS method

LI Jia-yin1, ZHANG Xiao-ping1, FANG Meng-ting2, ZHANG Zi-wen2, YE Chun-ying2, JI Xiang-yu2, WEI Zhen-zhen2, ZHAN Shu-yu2

1. Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Jiaxing University, Jiaxing 314001, China 2. Medical College, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China

To establish a new method of quantitative analysis of multi-components with a single-marker (QAMS) for simultaneously determination of 12 components in Shengmai Injection (生脈注射液, SMI).Ginsenoside Rb1was used as the reference to calculate the relative correction factors (f/s) of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rf, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rh1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rb3, ginsenoside Rd, ginsenoside 20()-Rg3, schisandrin and schisandrin B by HPLC, and then the durability off/swas investigated. The feasibility and accuracy of QAMS method were validated by comparing the determination of 12 components in SMI with the external standard method (ESM).The repeatability off/sfor each component was good. There was no significant difference (RSD < 3%) between the measured values of QAMS method and ESM. There were significant difference in the components contents of SMI from different manufacturers and different batch numbers. The concentrations of ginsenoside Rg1, Re, Rf, Rb1, Rh1, Rc, Rb2, Rb3, Rd, 20()-Rg3, schisandrin and schisandrin B in 14 SMI samples were 83.3—141.9, 85.9—183.2, 34.6—64.4, 137.0—316.4, 47.2—99.1, 84.6—235.0, 60.9—147.9, 9.5—28.7, 32.2—117.2, 17.4—34.7, 9.8—23.9 and 2.0—8.7 μg/mL, respectively.The established QAMS method has high accuracy and it can be used for the simultaneous quantitative determination of multiple components in SMI. This method will provide a method reference for the comprehensive quality control of SMI.

Shengmai Injection; QAMS; ginsenoside; schisandrin; schisandrin B; quality control

R286.02

A

0253 - 2670(2021)24 - 7484 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.010

2021-07-15

國家自然科學基金資助項目（81503338）；浙江省自然科學基金資助項目（LGF22H280004）；浙江省自然科學基金資助項目（LY18H280011）；嘉興市科技計劃項目（2018AD32102）；嘉興學院重點SRT項目（CD8517213303）；第二批嘉興市省市共建醫學重點學科—心血管病學（2019-ss-xxgbx）；心肌缺血的基礎與臨床研究創新團隊（2018-xjqxcxtd）

李佳寅，碩士，主治醫師。E-mail: 350830794@qq.com

詹淑玉，博士，副教授，研究方向為中藥藥理學與中藥藥動學。Tel: (0573)83643865 E-mail: zhansy2000@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]