基于生物信息學(xué)預(yù)測蒲公英干預(yù)炎癥的“藥效網(wǎng)絡(luò)”及機制研究

王騰宇 白根本

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488）

蒲公英是菊科蒲公英屬植物蒲公英（Ta-raxacum mongolicumHand.Mazz.）、堿地蒲公英（Tarax-acum sinicum Kitag）及同屬植物的干燥的全草。蒲公英始載于《唐本草》，入肝、胃經(jīng)，主要分布于我國西南和西北等地區(qū)，其味苦、甘，性寒，具清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等作用，臨床主要用于各種炎癥、胃潰瘍等多種疾病的治療[1]。

蒲公英主要含有萜類、有機酸類、總黃酮類、多糖類成分和其他類成分。萜類主要包括三萜和倍半萜類成分，如偽蒲公英甾醇棕櫚酸酯等三萜類成分和蒙古蒲公英素B等倍半萜類成分；有機酸類成分主要包括綠原酸、咖啡酸、棕櫚酸等，其中綠原酸和咖啡酸具有抗菌活性；黃酮類是蒲公英有效成分，以蘆丁為代表，含量較大；蒲公英多糖為其具有抗氧化活性的代表；其他類成分包括香豆素、木質(zhì)素等[2]。

炎癥是機體對致炎因子的損傷所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主，損傷和抗損傷并存的基本病理過程。中醫(yī)認(rèn)為所謂炎癥是邪正斗爭，陰陽失調(diào)，升降失常所致。平家奇等[3]通過建立二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型等，證明蒲公英提取物具有明顯的體內(nèi)抗炎作用。Kim等[4]研究了蒲公英葉提取物對P物質(zhì)和脂多糖刺激的原代培養(yǎng)大鼠星形細(xì)胞中腫瘤壞死因子（TNF-α）的影響，推斷蒲公英葉提取物有明顯的抗炎活性。

生物信息學(xué)是一種基于網(wǎng)絡(luò)視角、整體水平觀察藥物作用靶點或藥效基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物，識別新藥靶點的研究新策略[5]。生物信息學(xué)能從系統(tǒng)水平探索中藥調(diào)控機體治療疾病的多成分、多靶點的機制，并逐漸作為一種創(chuàng)新型的研究策略被引入到中藥及其復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中。本研究采用生物信息學(xué)方法分析中藥蒲公英抗炎活性成分和可能的分子作用機制，為蒲公英質(zhì)量控制提升、藥效基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 靶點及其對應(yīng)有效成分的預(yù)測 首先采用數(shù)據(jù)挖掘法挖掘BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中蒲公英抗炎活性的潛在靶點，并登陸B(tài)ATMAN-TCM服務(wù)器（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm），分別上傳蒲公英的主要靶點，得到每個靶點對應(yīng)的有效成分篩選結(jié)果，將兩部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行整合[6]。BATMAN-TCM系統(tǒng)可以分析疾病靶點富集度的顯著性水平并對有效成分與目標(biāo)靶點相關(guān)性進(jìn)行評分（score）。通過統(tǒng)計分析，選擇合適的計算方法預(yù)測傳統(tǒng)中藥治療疾病的顯著性P值，最終選擇有統(tǒng)計學(xué)意義的預(yù)測蒲公英所治療的疾病。以P＜0.05作為“藥物-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的數(shù)據(jù)。以P＜0.05，score cutoff=10為基準(zhǔn)，顯示蒲公英治療炎癥的顯著性分析，及所對應(yīng)的靶點和有效成分。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 根據(jù)上述預(yù)測結(jié)果，使用Cytoscape軟件中的關(guān)聯(lián)功能（Merge），將篩選出的活性成分、潛在靶點以及與靶點對應(yīng)的疾病信息構(gòu)建一個藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。在生成的網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物、蛋白質(zhì)或疾病，邊代表化合物-靶點以及靶點-疾病相互作用。

1.3 KEGG通路分析 KEGG數(shù)據(jù)庫是一個聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫，其子數(shù)據(jù)庫PATHWAY匯集了分子交互作用及其反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)人工通路圖。BATMAN-TCM是一個基于網(wǎng)絡(luò)訪問的功能注釋系統(tǒng)，利用BATMAN-TCM工具分析KEGG pathway可以直觀觀測到蒲公英的富集通路目標(biāo)基因?qū)?yīng)的蛋白及相互關(guān)系，有助于了解疾病的分子學(xué)機理，并為新藥的研發(fā)提供有效參考靶點。

1.4 GO Ontology分析 基因本體GO（Gene Ontology）體系集成了多種異質(zhì)數(shù)據(jù)庫的信息，用結(jié)構(gòu)化的自然語言術(shù)語對基因和基因產(chǎn)物的功能進(jìn)行注釋和分類，是研究基因功能相似性的有力工具。利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分析，蒲公英在基因本體論的生物學(xué)進(jìn)程（biological process）富集分析。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英干預(yù)炎癥的靶點篩選 檢索BATMANTCM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，蒲公英中具有抗炎活性的靶點共9個（見表1），與炎癥經(jīng)典通路基本吻合。

表1 蒲公英中具有抗炎活性的對應(yīng)靶點（P＜0.05，score cutoff=10）

2.2 蒲公英的活性成分篩選 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫整理出蒲公英中共14個化合物，手動篩選蒲公英干預(yù)炎癥的靶點對應(yīng)成分共5個（見表2），為菊黃質(zhì)、毛茛黃素、咖啡酸、七葉內(nèi)酯和膽堿，主要涉及了生物堿、木質(zhì)素、皂苷、萜類等。

表2 蒲公英抗炎的活性成分篩選（P＜0.05，score cutoff=10）

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 使用Cytoscape軟件構(gòu)建在抗炎方向蒲公英活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)模型，如圖1所示。從圖中可以看出，5個主要活性成分的9個潛在靶點對比到炎癥上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現(xiàn)了蒲公英多成分、多靶點的作用機制。

圖1 蒲公英抗炎活性的靶點-成分網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 KEGG通路分析 在KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析結(jié)果排名前5的通路分別為視黃醇代謝（Retinol Metabolism）、類固醇生物合成（Steroid Biosynthesis）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid Metabolism）、醚脂質(zhì)代謝（Ether Acid Metabolism）、花生四烯酸代謝（Arachidonic Acid Metabolism），見圖2。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集結(jié)果（前5）

2.5 GO Ontology分析 在基因本體論（GO）的生物學(xué)進(jìn)程（biological_process）富集分析結(jié)果排名前5的生物學(xué)進(jìn)程分別為脂質(zhì)代謝過程（Lipid Metabolic Process）、脂質(zhì)結(jié)合（Lipid Binding）、氧化還原酶活性（Oxidoreductase Activity）、小分子代謝過程（Small Molecule Metabolic Process）、次代謝過程（Secondary Metabolic Process），見圖3。

圖3 GO生物學(xué)進(jìn)程（Biological Process）富集分析結(jié)果

3 討論

藥效相互作用網(wǎng)絡(luò)是研究藥物作用或機制分子基礎(chǔ)的新途徑和新方法，也是目前國際上生物信息學(xué)研究的熱點之一。發(fā)現(xiàn)并建立成分與疾病相關(guān)的分子作用網(wǎng)絡(luò)，對于研究復(fù)雜疾病機制至關(guān)重要，也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)所面臨的重大挑戰(zhàn)。生物信息學(xué)依靠數(shù)據(jù)挖掘，探索疾病表型-基因-靶點-藥物相互作用的相互關(guān)系，通過網(wǎng)狀分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，尋找可能的組合藥物靶標(biāo)，預(yù)測相關(guān)疾病的治療靶點和成分。

本研究以蒲公英為例，采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘的方法考察蒲公英治療疾病的分布情況，并將其與相關(guān)靶點進(jìn)行對接，根據(jù)疾病與靶點相關(guān)性推測蒲公英具有抗炎活性可能的機制，并進(jìn)一步對蒲公英的藥理作用進(jìn)行了KEGG和GO富集分析。計算結(jié)果表明，蒲公英抗炎的作用機制靶點包括腺苷酸激酶（ADK）、腺苷A1受體（ADORA1）、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶（CHUK）等。

腺苷酸激酶（ADK）是一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，也是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，與其他的磷酸轉(zhuǎn)移酶共同維持細(xì)胞中核苷酸的正常含量，在能量代謝、細(xì)胞生長活動中起著十分重要的作用[7]。在缺血、缺氧或者炎癥等惡劣的環(huán)境下，局部組織中腺苷的濃度會相應(yīng)升高，調(diào)節(jié)局部組織和細(xì)胞的能量代謝，保護(hù)其免受外界因素的損傷，促進(jìn)血管生成和毛細(xì)血管密度增加。腺苷受體（ADOR）由A1、A2a、A2b和A3 4種亞型組成，這4種亞型都是G蛋白偶聯(lián)受體。腺苷及其受體參與了各種各樣的生物過程，腺苷受體的激活具有調(diào)控炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能，可以調(diào)控炎癥微環(huán)境。此外，螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶（CHUK）編碼的蛋白可使核錄因子NF-κB信號通路上的節(jié)點磷酸化，從而激活NF-κB，最終促進(jìn)成套促炎基因的表達(dá)，從而使炎癥加重[8]。

本研究中蒲公英的化學(xué)成分與相關(guān)靶標(biāo)的相互作用研究能初步揭示其分子基礎(chǔ)及復(fù)雜的作用機理。此外，生物信息學(xué)的應(yīng)用可提示中藥相關(guān)藥理作用靶點，篩選中藥有效靶成分，大大減少實驗工作量，降低中藥新藥開發(fā)及研究的風(fēng)險，有助于中藥現(xiàn)代化發(fā)展及創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)。但僅基于數(shù)據(jù)庫的化學(xué)成分的分析，不經(jīng)含量篩選納入所有化合物信息，可能錯誤高估含量極低、非特征性化合物在中藥材及其復(fù)方中的作用。因此，利用中藥化學(xué)提取技術(shù)找到與該藥功能主治相吻合的有效成分，揭示其成分含量、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可彌補生物信息學(xué)的不足。因而，綜合應(yīng)用生物信息學(xué)和中藥化學(xué)先進(jìn)理念和技術(shù)，靶向提高中藥復(fù)方吸收率和純度，明確藥物作用機制，是科學(xué)研究中藥的關(guān)鍵。

[1] 于立恒.蒲公英藥理作用研究進(jìn)展[J].實用中醫(yī)藥雜志，2012，28（7）：617.

[2] 謝沈陽，楊曉源，丁章貴，等.蒲公英的化學(xué)成分及其藥理作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（1）：141.

[3] 平家奇，劉利本，鄒娟，等.蒲公英提取物體內(nèi)抗炎作用研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2010，32（1）：52.

[4] KIM H M，SHIN H Y，LIM K H，et al.Taraxacum officinale inhibits tumor necrosis factor-alpha production from rat astrocytes[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2000，22（3）：519.

[5] LIU X，ZHANG M，HE L，et al.Chinese herbs combined with Western medicine for severe acute respiratory syndrome（SARS）[J].Cochrane Database Syst Rev，2012，10：CD004882.

[6] LIU Z，GUO F，WANG Y，et al.BATMAN-TCM：a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine[J].Sci Rep，2016，6：21146.

[7] DECLERCK P J，MüLLER M.Hydrogenosomal ATP：AMP phosphotransferase of Trichomonas vaginalis[J].Comp Biochem Physiol，B，1987，88（2）：575.

[8] HAYDEN M S，GHOSH S.Shared principles in NF-kappaB signaling[J].Cell，2008，132（3）：344.