急性髓系白血病患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表達及意義

王萍 高紅秀 任曉艷 郭力 吳勝勝

作者單位：駐馬店市中心醫院血液內科，河南，駐馬店463000

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）又被稱作急性非淋巴細胞白血病或急性粒細胞白血病，是一種較為常見的造血系統惡性增生性疾病，疾病早期患者血細胞數目明顯減少，并引發發熱、倦怠、食欲減退等癥。目前，對于AML的發病機制尚未十分明確，對于急性早幼粒細胞白血病患者通過系統治療近期生存率較高，而其他AML 患者多病情急重，復發率高，預后差，因而尋找有效評估AML 病情預后的標志物及相關治療靶點具有重要意義。CD73 為存在于細胞膜上的一類5′-核苷酸酶，與人體正常淋巴細胞的分化、發育有關。近年來研究顯示［1］，CD73 與急性白血病、慢性髓系白血病等患者預后存在密切聯系。DJ-1基因又被稱為PARK7基因，具有抗氧化、抑制細胞凋亡等多種功能，研究證實［2］，DJ-1基因表達與多種惡性腫瘤的發生、侵襲轉移及預后相關，可作為惡性腫瘤的診斷及治療靶點。溶酶體相關膜蛋白（lysosome-associated membrane protein，LAMP）為溶酶體膜蛋白的主要組成成分，其中LAMP4 主要定位于內膜系統，主要參與細胞的吞噬作用、細胞癌變等過程，在惡性腫瘤的診斷和預后研究中應用較廣［3］。因此，本研究分析了AML患者CD73、DJ-1及LAMP4基因表達情況，以期為AML 的臨床診斷提供有效分子標記及治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取駐馬店市中心醫院血液內科2018年1月至2020年1月初診為AML 的70 例患者的骨髓標本作為研究組，納入標準：①符合《血液病診斷及療效標準（第3 版）》［4］中的診斷標準；②自愿參與本研究并簽署知情同意書；③非APL 患者采用IA方案化療；④均為初次確診。排除標準：①合并其他部位腫瘤者；②無法配合研究進行者；③肝腎等臟器功能異常者；④合并其他影響本研究結果的因素。其中，男39 例，女31 例，年齡平均（51.1±3.2）歲，依照FAB 標準［5］分為M0（5 例）、M1（6例）、M2（30 例）、M4（4 例）、M5（19 例）、M6（6例）。另選取10 例于本院行骨髓穿刺檢查的非血液系統腫瘤疾病的骨髓捐獻者骨髓穿刺標本作為對照組，其中男6 例，女4 例，年齡平均（49.6±3.4）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標統計

統計所有患者性別、年齡、法國-美國-英國（French-American-British，FAB）白血病分型標準、貧血程度及世界衛生組織（World Health Organization，WHO）疾病危險度分級［6］，并檢查血液白細胞、血小板、幼稚細胞組等實驗室指標。

1.2.2 CD73、DJ-1及LAMP4mRNA水平檢測

采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測CD73、DJ-1及LAMP4基因表達：所有患者入院確診后立即抽取2 mL 骨髓血，梯度離心20 min 獲得1～2×106個骨髓單個核細胞，PBS 洗滌，提取細胞總RNA。采用QuantiNova SYBR Green PCR Kit 試劑盒（購自德國Qiagen 公司）提取總RNA，Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（購自天根公司）逆轉錄獲取cDNA。CD73、DJ-1及LAMP4 引物均由上海生物工程公司合成。CD73 引物序列，上游：5′-CACCAAGGTTCAGCAGATCCG-3′，下游：5′-GTTCATCAATGGGCGACCGG-3′。DJ-1 引物序列：上游：5′-GTGTAGCCGTGATGTGGTC-3′，下游：5′-GCT CCTTCAGTATCTCCTTCAC-3′。LAMP4 引物序列：上游：5′-GACAAGTACAACGTGAGCGG-3′，下游：5′-CGAGGTCTTGTTGGGGTTGA-3′。內參照β-actin 引物序列，上游：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。熒光定量PCR 擴增獲取溶解曲線、擴增曲線，采用2-△△Ct計算CD73、DJ-1及LAMP4基因相對定量表達水平。

1.2.3 預后分析

依照《血液病診斷及療效標準（第3 版）》［4］中標準定義病人緩解定義為外周血象恢復，骨髓原始細胞＜5%。并根據緩解情況分為未緩解（none remission，NR）、部分緩解（partial remission，PR）和完全緩解（complete remission，CR）。所有患者隨訪6～36 個月，統計患者預后生存情況，計算生存率和中位生存時間。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組CD73、DJ-1及LAMP4基因表達水平比較

研究組CD73、DJ-1及LAMP4mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

表1 兩組CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels between 2 groups（±s）

組別對照組研究組t 值P 值n 10 70 CD73 0.24±0.07 0.77±0.20 16.268 0.000 DJ-1 0.51±0.11 2.52±0.39 34.558 0.000 LAMP4 mRNA 0.28±0.07 0.42±0.09 4.710 0.000

2.2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關性

CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達水平與患者性別、年齡、貧血程度、血小板計數、幼稚細胞計數無相關性（P＞0.05），與疾病危險程度分級、白細胞計數、FAB 分型存在顯著相關性（P＜0.05）。見表2。

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

表2 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者臨床特征的相關性（±s）Table 2 Correlation between CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA and clinical characteristics of AML patients mRNA（±s）

項目性別t 值P 值年齡t 值P 值FAB 分型F 值P 值貧血程度F 值P 值白細胞計數t 值P 值血小板計數F 值P 值幼稚細胞比例t 值P 值疾病危險程度分級F 值P 值男女≤60＞60 M0 M1 M2 M4 M5 M6正常輕中度重度≤50＞50＜50 50～100＞100 0～0.5 0.5～1.0低中高n 39 31 49 21 5 6 3 0 4 1 9 67 49 14 50 20 46 12 12 23 47 21 37 12 CD73 0.78±0.22 0.75±0.20 0.590 0.557 0.76±0.17 0.77±0.23 0.202 0.840 0.64±0.20 0.65±0.22 0.94±0.20 0.63±0.18 0.77±0.23 0.61±0.20 8.699 0.000 0.77±0.22 0.74±0.21 0.79±0.25 0.186 0.854 0.59±0.17 0.83±0.22 4.894 0.000 0.78±0.19 0.72±0.23 0.77±0.23 0.155 0.877 0.76±0.15 0.78±0.26 0.610 0.544 0.52±0.14 0.63±0.18 0.96±0.22 7.041 0.000 DJ-1 2.55±0.43 2.51±0.37 0.411 0.682 2.46±0.47 2.53±0.41 0.592 0.556 2.30±0.29 2.31±0.36 2.96±0.62 2.33±0.35 2.70±0.28 2.25±0.21 9.153 0.000 2.50±0.42 2.53±0.44 2.54±0.41 0.219 0.829 2.33±0.36 3.19±0.47 8.253 0.000 2.51±0.45 2.55±0.51 2.56±0.39 0.387 0.700 2.52±0.44 2.53±0.41 0.094 0.926 2.16±0.24 2.33±0.34 2.98±0.42 6.209 0.000 LAMP4 mRNA 0.42±0.09 0.43±0.08 0.485 0.629 0.40±0.11 0.43±0.09 1.101 0.275 0.43±0.08 0.44±0.12 0.66±0.15 0.55±0.10 0.58±0.13 0.43±0.09 10.314 0.000 0.40±0.07 0.43±0.09 0.41±0.09 0.267 0.792 0.30±0.06 0.52±0.13 7.265 0.000 0.44±0.09 0.44±0.11 0.42±0.08 0.770 0.444 0.41±0.09 0.42±0.13 0.331 0.741 0.25±0.05 0.45±0.06 0.67±0.15 9.405 0.000

2.3 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者治療效果的相關性

70 例患者經過治療后完全緩解率為74.3%（52/70），依照AML 患者入院確診后測定的CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 均值為分界線分為低于均值的低表達組和高于均值高表達組并對比顯示，CD73、DJ-1及LAMP4 低表達的AML 患者完全緩解率顯著高于高表達患者，且治療緩解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 表達較治療前明顯降低（P＜0.05）。見表3～4。

表3 不同CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 表達水平治療后CR 比較［n（%）］Table 3 Comparison of CR after treatment with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA［n（%）］

2.4 CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA 與AML 患者預后的相關性

所有患者隨訪6～36 個月，平均（21.3±2.4）個月，預后良好的AML 患者入院確診后測定的CD73、DJ-1及LAMP4 較預后不良患者表達水平較低，且CD73、DJ-1及LAMP4 低表達的AML 患者總體生存率及中位生存時間顯著高于高表達患者（P＜0.05）。見表5～6。

表5 不同預后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

表5 不同預后的AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients with different prognosis（±s）

項目預后良好預后不良t 值P 值n 52 18 CD73 0.48±0.08 0.83±0.12 11.520 0.000 DJ-1 1.96±0.26 2.71±0.47 6.438 0.000 LAMP4 mRNA 0.36±0.10 0.62±0.14 8.538 0.000

表4 治療緩解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

表4 治療緩解前后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of CD73，DJ-1 and LAMP4 mRNA levels in AML patients before and after treatment remission（±s）

時間緩解前緩解后t 值P 值n 52 52 CD73 0.75±0.08 0.32±0.15 18.240 0.000 DJ-1 2.36±0.26 0.77±0.20 34.954 0.000 LAMP4 mRNA 0.41±0.10 0.31±0.10 5.099 0.012

3 討論

AML 以造血干細胞/祖細胞異常增殖、分化受阻和凋亡抑制為主要特征的高度異質性血液系統疾病，隨著遺傳學及分子醫學的不斷發展，研究顯示基因突變、染色體易位及造血細胞免疫表型改變與白血病的發生發展密切相關，對AML 患者的治療反應和預后均有一定的影響［7］。因此，研究AML 患者相關分子表達對于尋找患者個體化治療、基因治療的分子靶點及了解AML 的發生發展分子機理等具有重要意義。

CD73 為分布于多種細胞細胞膜上的一類白細胞抗原，具有磷酸轉移酶和水解酶兩種酶活性，在維持核苷酸代謝平衡中具有重要作用。近年來報道顯示［8］，CD73 與白血病患者治療預后及分型相關；另有研究證實［9］，AML 患者核苷酸水解酶活性越強，患者白血病相關細胞分化程度越低，預后也越差。DJ-1 基因為新發現的一類絲裂原依賴性癌基因，在胃癌、肝細胞癌等多種實體腫瘤中廣泛表達，在調節腫瘤細胞凋亡、促進細胞增殖、轉錄、侵襲、轉移等方面發揮重要作用［10-11］。研究顯示在初治急性白血病及骨髓增生異常綜合征患者的骨髓標本中DJ-1基因表達水平明顯增加［12］。溶酶體為細胞質中重要的細胞器，參與了細胞免疫、代謝、自噬等生理過程，LAMP4 為主要定位于溶酶體的巨噬細胞表面分子標記物，可能通過調節AML 細胞的凋亡抑制和分化阻滯參與疾病的發生發展。研究指出［13］，LAMP4 在胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中高表達，并與惡性腫瘤患者臨床病理特征存在密切關系。本研究結果顯示，在AML 患者骨髓標本中CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達水平明顯高于正常人群的骨髓標本。研究結果CD73、DJ-1及LAMP4mRNA 表達水平與AML 患者臨床特征、疾病發展有著顯著關系，可能為AML 發生發展的危險因素，這與一些研究的結果相類似［14-16］。

表6 不同CD73、DJ-1及LAMP4 表達水平AML 患者總體生存率及中位生存時間比較Table 6 Comparison of overall survival rate and median survival time of AML patients with different expression levels of CD73，DJ-1 and LAMP4

本研究結果還顯示，CD73、DJ-1及LAMP4低表達的AML 患者完全緩解率顯著高于高表達患者，且治療緩解后AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表達較治療前明顯降低。同時，預后良好的AML患者CD73、DJ-1及LAMP4較其他患者表達水平較低，且CD73、DJ-1及LAMP4低表達的AML 患者總體生存率及中位生存時間顯著高于高表達患者。因此，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4表達水平越高，患者治療效果及預后越差，而抑制CD73、DJ-1及LAMP4表達可延長患者生存時間，提升患者生存率。因而檢測CD73、DJ-1及LAMP4表達有助于AML 患者的診斷和預后判斷，但其具體的機制尚需進一步深入探討。綜上所述，AML 患者CD73、DJ-1及LAMP4呈高表達，結合患者臨床特征及治療前后三指標表達變化有助于判斷患者預后，并為臨床治療提供參考。