糞便中脫落細(xì)胞基因檢測在炎癥性腸病診斷中的臨床價(jià)值

劉秀卿 顧大勇 李延武 郭海建 李太晗

作者單位：深圳市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東，深圳518035

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）發(fā)病率為1.74/10 萬，近年來呈上升趨勢［1］，以南方地區(qū)多發(fā)，是消化道常見慢性非特異性炎癥病變。IBD 主要病變在腸道，但也可累及多種器官、系統(tǒng)，故需盡早診療，雖然IBD 治愈率低，但通過一系列治療后，可緩解病情，使得患者能夠像正常人群一樣工作、生活，為了保證患者后期得到及時(shí)、有效救治，還需注重疾病篩查，以便及時(shí)為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)［2］。組織病理學(xué)檢查、內(nèi)鏡檢查是評(píng)估腸道炎癥活動(dòng)度的金標(biāo)準(zhǔn)，雖診斷準(zhǔn)確率高，但反復(fù)內(nèi)鏡檢查可給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且存在出血、穿孔等風(fēng)險(xiǎn)，加重身心負(fù)擔(dān)，故無法首推［3］。糞便DNA 檢測具有診斷效能高、方便、無創(chuàng)等優(yōu)勢，其中DNA 甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前已有學(xué)者用于結(jié)直腸癌檢測中［4］，通過檢測糞便中脫落細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物來判斷患病風(fēng)險(xiǎn)，其中使用的目標(biāo)基因?yàn)轲そY(jié)蛋白聚糖2（Syndecan 2，SDC2），內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白（β-actin，ACTB），而且在該技術(shù)的開發(fā)過程中，也觀察到一些IBD患者出現(xiàn)了ACTB基因水平異常升高，但當(dāng)前未有深入研究。本文就此展開深入調(diào)查，分析SDC2、ACTB在預(yù)測IBD 中效能以及與臨床病理特征相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 資料

分析在2020年6月至2021年6月深圳市第二人民醫(yī)院收集的70 例IBD患者（觀察組）、30例健康人群（對(duì)照組）作為研究對(duì)象。觀察組男性48 例，女性22 例，平均年齡（47.45±4.53）歲，平均體重（62.35±4.46）kg；對(duì)照組男性18 例，女性12 例，平均年齡（47.33±4.49）歲，平均體重（62.49±4.58）kg。兩組性別、體重、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。符合《赫爾辛基宣言》［5］倫理審查。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《炎癥性腸病外科治療國內(nèi)外共識(shí)與指南》［6］中關(guān)于IBD 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②自愿提供糞便樣本，接受糞便DNA檢測；③沒有任何腫瘤病史；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并脊柱嚴(yán)重畸形者；②有切口疝或腹部疝氣者；③可疑結(jié)腸穿孔者；④因直腸、肛門畸形或高度狹窄結(jié)腸鏡無法插入者；⑤下消化道嚴(yán)重梗阻，無法排便、排氣者。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 樣本收集

收集受檢者各項(xiàng)基本信息，包括年齡、性別、姓名、家族史、聯(lián)系方式、疾病史等。在接受腸鏡檢查后7～30 天進(jìn)行糞便樣本采集，在采集前囑咐受檢者正常飲食，對(duì)于服用黃連素等影響檢測結(jié)果者，需停藥一周。收集糞便樣本時(shí)，嚴(yán)格按照說明書操作，保證DNA 樣本不降解，采樣后24 h 內(nèi)送至檢驗(yàn)科。

1.3 檢測方式

進(jìn)行糞便DNA 提取和qPCR 檢測。首先將糞便樣本震蕩混勻，離心10 min，5 000 rpm，取上清，保存于-80℃，待檢。檢測時(shí)，先從冰箱取出樣本，待融解后，取3.2 mL 上清過SPE 柱，將雜質(zhì)去除，加入特異性磁珠捕獲目標(biāo)基因，提取的基因組DNA，取2 μL 用超微量分光光度計(jì)Nanodrop one測定儀測定濃度及純度。開展qPCR 法檢測，使用廣州康立明生物人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒（國械注準(zhǔn)20183400506）與上海宏石全自動(dòng)醫(yī)用分析系統(tǒng)SLAN-96S，采用熒光PCR 法檢測ACTB、SDC2。具體步驟如下：取10 μL 糞便樣本中提取的DNA，加入1×GoTaq 緩沖液，5 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs，2.5 U GoTaq 熱啟動(dòng)聚合酶（Promega），上下游引物各0.5 μM，0.2 μM Taqman 探針，總反應(yīng)體系30 μL。在PCR 儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件：變性95℃5 min，（95℃15 s，58℃30 s，72℃30s）×48 個(gè)循環(huán)，冷卻40℃30 s。各基因臨界值：根據(jù)ACTBCt 臨界值26.86，ACTB的Ct 值＜26.86 為陽性，Ct 值≥26.86 為陰性；SDC2Ct 臨界值38.97，SDC2的Ct值＜38.97 為陽性，Ct 值≥38.97 為陰性。陽性率=陽性標(biāo)本例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（）表示，行t檢驗(yàn)，F(xiàn)值采用方差分析；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析ACTB的Ct 值、SDC2甲基化的Ct值及兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測價(jià)值；采用Spearman 法分析相關(guān)性；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比較

兩組SDC2甲基化檢測Ct 值、陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），觀察組ACTB的陽性率高于對(duì)照組，ACTBCt 值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of actb gene level and SDC2 methylation level between the two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組ACTB 基因水平和SDC2 甲基化水平比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of actb gene level and SDC2 methylation level between the two groups［n（%），（±s）］

組別觀察組對(duì)照組χ2/t 值P 值n 70 30 ACTB陽性率67（95.71）3（10.00）73.469＜0.001 Ct 值25.78±1.63 32.12±1.13 19.375＜0.001 SDC2陽性率5（7.14）2（6.67）0.007 0.932 Ct 值40.78±1.25 40.79±1.33 0.396 0.693

2.2 ROC 曲線分析

經(jīng)ROC 曲線分析，內(nèi)參基因ACTB、SDC2甲基化Ct 值預(yù)測炎癥性腸病的AUC 分別為0.918、0.473（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 分析各項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測預(yù)后的AUC 值Table 2 Analysis of the AUC value of various indicators to predict prognosis

圖1 ACTB Ct、SDC2 Ct 預(yù)測的ROC 曲線圖Figure 1 ACTB Ct，SDC2 Ct predicted ROC curve

2.3 觀察組不同臨床病理特征的ACTB 基因水平的比較

不同性別、年齡段患者內(nèi)參基因ACTB的Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同病程、病變位置患者內(nèi)參基因ACTB的Ct 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 觀察組不同臨床病理特征的ACTB 基因水平的比較Table 3 Comparison of ACTB gene levels with different clinicopathological characteristics in observation group

2.4 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 法分析，內(nèi)參基因ACTB水平與年齡、性別不存在相關(guān)性（P＞0.05），與病程、病變位置呈正相關(guān)性（P＜0.05）。見表4。

表4 內(nèi)參基因ACTB水平與臨床病理特征的相關(guān)性分析Table 4 Correlation between ACTB level of internal reference gene and clinicopathological features

3 討論

診斷IBD 金標(biāo)準(zhǔn)為腸鏡聯(lián)合組織學(xué)病理檢查，雖準(zhǔn)確率較高，但屬于創(chuàng)傷性操作，且存在出血、穿孔等風(fēng)險(xiǎn)，患者依從率較低［7］。糞便潛血實(shí)驗(yàn)是早期臨床推薦的非侵入手段，雖具有無創(chuàng)、簡便優(yōu)勢，但特異性、敏感性低，尤其是對(duì)于微小病變者，誤診率較高。因此，基于糞便、血液等生物樣本的精準(zhǔn)無創(chuàng)檢測便成為腸道炎癥病變新選擇。有研究表明［8］，病變患者糞便中脫落細(xì)胞在堿性環(huán)境下，可減慢降解速度，因此學(xué)者提議將糞便中脫落細(xì)胞DNA 基因作為檢測標(biāo)本。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，分子生物學(xué)標(biāo)記已逐漸成為腸道病變新型無創(chuàng)檢測技術(shù)，通過測序技術(shù)分析DNA 基因突變，具有更好的特異性和敏感性，但測序技術(shù)成本較高，步驟復(fù)雜，不利于推廣于IBD 中。相比之下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測更值得推廣，具有成本低廉、步驟簡便優(yōu)勢，且作為非侵入性操作，更易被人們接受。

DNA 甲基化是腸道癌癥病變發(fā)生、發(fā)展中一個(gè)早期重要事件，故異常DNA 甲基化可作為早期診斷、預(yù)測病變的分子標(biāo)記物［9］。SDC2基因甲基化是腫瘤早期篩查分子標(biāo)記物；SDC2是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中成員之一，屬于I 型細(xì)胞表面跨膜蛋白聚糖，目前常作為腫瘤標(biāo)志物，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，與多種癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［10］。ACTB是actin 家族中一員，在細(xì)胞生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用［11］。本研究結(jié)果顯示，觀察組ACTB基因水平陽性率高于對(duì)照組，ACTBCt 值低于對(duì)照組，說明IBD 病變存在明顯脫落細(xì)胞異常增多。主要是IBD 病變發(fā)展階段，NO 大量生成，會(huì)破環(huán)小腸上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)解體，從而引起上皮細(xì)胞功能失調(diào)，而ACTB基因參與了細(xì)胞遷移和分裂，在IBD 充質(zhì)細(xì)胞中存在異常表達(dá)，故引起內(nèi)參基因ACTB表達(dá)異常升高［12-13］。經(jīng)ROC 曲線分析，內(nèi)參基因ACTB、SDC2甲基化Ct 值預(yù)測炎癥性腸病的AUC 分別為0.918、0.473，說明內(nèi)參基因ACTB檢測效能較高，能有效避免盲目大規(guī)模腸鏡篩查帶來的弊端和創(chuàng)傷性，同時(shí)節(jié)約了醫(yī)療資源，提高檢測陽性率［14］。而SDC2基因甲基化在腸炎中無特異性表現(xiàn)，敏感性和特異性較低，曹亞萍［15］學(xué)者發(fā)現(xiàn)SDC2基因在腸癌患者以及癌前病變中表現(xiàn)為異常的高度甲基化，在其他良性疾病（包括腸炎）中則沒有表現(xiàn)為高度甲基化。此外，經(jīng)Spearman 法分析，ACTB與年齡、性別不存在相關(guān)性，與病程呈正相關(guān)性，說明ACTB可受到疾病嚴(yán)重程度影響。而與病變位置也存在正相關(guān)性的原因可能是基因組DNA 來源不同，且本研究納入例數(shù)也較少，可對(duì)結(jié)果造成一定影響，故關(guān)于病變位置與脫落細(xì)胞ACTB基因的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，糞便中脫落細(xì)胞基因檢測是一項(xiàng)靈敏性高、無創(chuàng)、簡便、檢測迅速的篩查技術(shù)，內(nèi)參基因ACTB用于IBD 篩查中，可提高診斷效能，對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展起到一定預(yù)測評(píng)估作用，而SDC2甲基化與腸炎無直接關(guān)系。但本次研究樣本量較小，可造成分類偏差大，并未進(jìn)行長期隨訪，故關(guān)于脫落細(xì)胞ACTB基因檢測效能還需進(jìn)一步探索。