基于生物信息學分析ESPL1基因在肺腺癌中表達與突變的臨床意義

柳家翠 黃奔 程慶元 蔡偉國 段怡平 陳梁玥 馬甜甜 朱翠雯 喻明霞★

作者單位：1.武漢大學中南醫院基因診斷中心，湖北，武漢430071

2.武漢大學中南醫院影像科，湖北，武漢430071

肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌主要的組織學類型［1］。肺癌患者五年生存率僅為15%，盡管治療取得一定進展，但生存率僅小幅提升［2］。因此，深入認識肺癌分子發病機制，尋求有效的新型標志物進行分子靶向治療，對改善肺癌患者的總體生存期具有重要意義。外紡錘體極樣蛋白1（Extra spindle poles-like 1 protein，ESPL1）具有半胱氨酸型內肽酶活性，其編碼的分離酶在染色體分離和細胞分裂過程中發揮重要作用［3］。分離酶的功能是在有絲分裂后期開始時裂解黏附素，從而釋放黏附的姐妹染色單體。分離酶還參與DNA 損傷修復、膜運輸等多種基本生物功能［4］。ESPL1表達受到嚴格調控以確保許多重要細胞生物學活動的正常運行。由于其在細胞周期和DNA 損傷修復中的重要性，ESPL1的表達異常或突變極可能與惡性腫瘤的發生發展有關。研究發現，ESPL1在乳腺癌［5］、前列腺癌［6］、子宮內膜癌［7］等腫瘤中異常表達，并影響患者預后。但是該分子在肺腺癌中的表達與臨床相關性還未有討論。因此，本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中的肺腺癌樣本數據，探索ESPL1在肺腺癌中的表達、突變及預后價值，并預測ESPL1在肺腺癌發生發展中的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 原始數據的下載及預處理

檢索并下載來自TCGA 官網（https：//portal.gdc.cancer.gov/）的肺腺癌（LUAD）的表達譜數據（535 例腫瘤組織樣本，59 例正常組織樣本）及相應臨床信息。使用Strawberry Perl 5.30.1 軟件將原始基因表達譜數據整理成基因表達矩陣文件并整理肺腺癌患者臨床資料。

1.2 ESPL1 表達、突變與患者臨床病理特征及預后的相關性分析

通過R 4.0.2 軟件中“limma”包、“beeswarm”包提取ESPL1在肺腺癌組織樣本和正常肺組織樣本中的表達量數據并分析比較兩組的表達差異；以ESPL1在肺腺癌患者中表達值中位數為界進一步將腫瘤組樣本分為高、低表達水平兩組。使用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件對ESPL1表達與臨床病理特征之間的相關性進行卡方檢驗。利用R 4.0.2 軟件“survival”包分析兩組之間總體生存率（overall survival，OS）的差異；根據下載整理的臨床病理信息，結合ESPL1表達量，研究ESPL1與年齡、性別、TNM 分期等臨床相關性。通過單因素和多因素COX 回歸分析判斷ESPL1在肺腺癌中預后價值。通過cBioportal 在線軟件分析ESPL1在TCGA 數據庫中的突變情況以及突變患者的生存率。

1.3 在線工具驗證ESPL1 在肺腺癌預后情況

使用GEPIA 在線數據庫（http：//gepia.cancerpku.cn/）、Kaplan Meier-plotter 在線數據庫（https：//kmplot.com/analysis/）分析ESPL1在肺腺癌中的表達與OS 的關系，詳細參數設置如下：①GEPIA 數據庫，Gene：“ESPL1”；Methods：“Overall survival”；Group Cutoff：“Median”；Dataset：“LUAD”，其他為數據庫默認條件；②Kaplan Meier-plotter 數據庫，Gene symbol：“ESPL1”；Survival：“OS”；Probe set options：“only JetSet best probe set”；COX regression：“multivariate”；其他條件選擇數據庫默認條件。

1.4 蛋白互作網絡的構建與基因富集分析

使用檢索相互作用基因數據庫（STRING 11.0，https：//string-db.org/）搜索工具在蛋白質水平上分析共表達基因之間的潛在交互作用，篩選條件為：中等置信分數＞0.95。利用Cytoscape 軟件（3.6.0 版，https：//cytoscape.org/.）對蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡進行可視化。使用GSEA 4.0.3 軟件對ESPL1進行基因富集分析。以Molecular Signature Database（MsigDB）數據庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數據集作為功能基因集進行富集分析。將ESPL1的表達水平分為高、低表達兩組。采用缺省加權富集統計的方法，隨機組合次數設1 000 次，其他參數設為默認值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗；Wilcoxon 秩和檢驗，使用Excel 將肺腺癌患者年齡、性別、TNM 分期等臨床信息進行量化賦值，采用單因素和多因素分析采用COX 比例風險回歸模型，生存分析采用KM 法，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESPL1 表達差異與突變分析

在肺腺癌組織中，ESPL1表達水平高于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1A-B。cBioportal 網站分析結果顯示，TCGA 數據庫的516 個腫瘤樣本中有8 個發生了ESPL1突變，突變率為1.6%。見圖1C。

圖1 ESPL1 在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達差異分析及突變情況Figure 1 Expression and mutation rate of ESPL1 in lung adenocarcinoma and normal lung tissues

2.2 ESPL1表達與臨床病理特征及預后相關性分析

ESPL1表達水平與性別和遠處轉移具有相關性，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。Stage 分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期與I 期相比，均高表達ESPL1，差異有統計學意義（P＜0.05）見圖2A，發生遠處轉移患者組ESPL1表達量顯著高于未發生遠處轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2D。

表1 ESPL1 與肺腺癌患者臨床病理特征的相關性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis between ESPL1and clinicopathological features of lung adenocarcinoma［n（%）］

圖2 ESPL1 表達量與肺腺癌患者臨床病理特征相關性分析Figure 2 Correlation analysis between ESPL1 expression and clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

2.3 ESPL1 表達、突變與肺腺癌患者預后的關系

TCGA-LUAD 數據集中，ESPL1高表達與肺腺癌患者不良預后有關，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3A。GEPIA 數據庫結果顯示，ESPL1高表達組具有不良預后，差異有統計學意義（HR=1.6，P＜0.05），見圖3B；Kaplan Meier-plotter 數據庫分析結果同樣顯示高表達ESPL1組肺腺癌患者OS 較差（HR=1.56，95%CI：1.37～1.77，P＜0.05），見圖3C；cBioportal 分析結果顯示發生ESPL1基因突變組生存率較低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3D。

圖3 ESPL1 在肺腺癌中的預后作用Figure 3 Prognosis of ESPL1in lung adenocarcinoma

2.4 單因素和多因素COX 回歸分析

stage 分期（HR=1.473，95%CI：1.196-1.814，P＜0.05）和ESPL1表達（HR=1.122，95%CI：1.014～1.241，P＜0.05）可以作為肺腺癌的獨立預后因素。見表2。

表2 單因素和多因素COX 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate COX regression analysis

2.5 PPI 網絡構建與GSEA 富集分析

共表達基因預測結果顯示KIF18B 是與ESPL1相關性最強的基因（spearman 相關系數為0.92，P＜0.05），見圖4A，與ESPL1共表達基因的蛋白互作網絡，見圖4B。GSEA 結果顯示ESPL1主要富集在細胞周期、卵母細胞減數分裂、堿基切除修復以及Wnt 信號通路等。見圖4C。

圖4 ESPL1 的PPI 網絡構建及GSEA 功能富集分析Figure 4 PPI network construction of ESPL1 and GSEA functional enrichment analysis

3 討論

染色體結構和數目的正常是細胞正常存活和維持細胞后代遺傳穩定性必不可少的基本條件。研究表明［8］，染色體的錯誤分離會導致DNA 損傷以及非整倍體的產生而這些改變將會導致包括惡性腫瘤在內的多種人類疾病的發生。而ESPL1基因表達的分離酶就是一種在細胞有絲分裂中促使姐妹染色單體分離從而防止染色體發生內聚的酶，目前研究較多并且與ESPL1具有顯著相關性的KIF18B是驅動蛋白8 家族的成員，與微管運動有關，和ESPL1一樣在細胞有絲分裂中發揮重要作用［9］。研究發現在特異性誘導乳腺高表達ESPL1的轉基因小鼠［10-11］中發生了乳腺腫瘤并且導致了非整倍體的產生。Mukherjee［12］與Shepard［13］等人發現了在斑馬魚和小鼠的早期致死胚胎存在ESPL1的純合缺失，說明ESPL1的基因突變可能對機體產生致死性嚴重影響。由ESPL1在細胞周期以及DNA 損傷修復中的重要作用來看，研究其在肺腺癌腫瘤病人的表達以及突變情況，為深入了解患者發病機制以及尋找相應治療靶點具有十分重要意義。

本研究結合多種生物信息學方法分析發現，ESPL1在肺腺癌的發生發展中扮演了重要角色。研究表明，發現腫瘤發生發展的特定抑制途徑或分子靶點是阻滯腫瘤進展以及減輕副作用的最具前景方法［14］。ESPL1有潛力成為腫瘤治療中具有吸引力的分子靶點。目前，分離酶在多種腫瘤中過表達并參與腫瘤相關調控通路，比如，據報道約四分之一過度表達分離酶的乳腺癌是p53 功能改變的Luminal-B 亞型［15］。因此，抑制分離酶活性的藥物等抑制劑可為腫瘤治療提供新思路。另外，Zhang 等［16］已經篩選出Sepin-1 作為分離酶靶點，Sepin-1 能夠抑制三陰性乳腺癌異種移植瘤生長，并且Sepin-1 的敏感性與腫瘤中ESPL1表達水平呈正相關。由此，可以通過檢測ESPL1在腫瘤病人的表達量并進行表達和突變分析，以作為是否滿足使用分子抑制劑的使用條件，從而實現對患者的個體化治療。

綜上所述，ESPL1在肺腺癌中表達明顯上調，且具有一定突變率。該基因的過表達與突變均與肺腺癌患者的惡性進展及不良預后有關。ESPL1有望成為腫瘤治療的新型分子標志物。