人類白細胞抗原基因分型檢測試劑盒行業標準的修訂與驗證

胡澤斌 王瑞霞 代蕾穎 曲守方★ 黃杰★

作者單位：1.中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所，北京100050

2.北京市醫療器械檢驗研究院，北京101111

人類白細胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA）的I 類A、B、C 位點和II 類DR、DQ 位點等位基因的分型檢測在造血干細胞移植，骨髓移植以及肝臟腎臟等其他組織器官移植的供體受體配型中發揮關鍵作用［1-2］。同時HLA-I 類B 座位的單位點如B27 和B5801 等基因分型檢測在強制性脊柱炎的輔助診斷和痛風用藥指導中也發揮重要作用［3-4］。目前，在國家藥品監督管理局取得醫療器械注冊證的HLA 基因分型檢測試劑盒約有十種，方法學包含聚合酶鏈反應-序列特異性引物法（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）、聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸探針法（polymerase chain reaction- sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）、基因測序分型法（sequence based genotyping，PCR-SBG）、熒光PCR 法等［5-7］。2010年原國家食品藥品監督管理局發布的行業標準YY/T 1180-2010《人類白細胞抗原（HLA）基因分型試劑盒（SSP 法）》［8］，為分子診斷領域較早制定的產品標準，僅針對當時較為流行的SSP 方法學的HLA 基因分型試劑盒，隨著HLA產品多樣性的增加，原條款適用性降低，按照國家藥品監督管理局2020年醫療器械行業標準制修訂計劃［9］，對其進行修訂。本研究選取16 批次不同方法學的HLA 基因分型試劑盒，對擬定標準的技術指標和檢驗方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 核酸分型檢測試劑盒（PCR-SBT 法），由德必碁生物科技（廈門）有限公司提供；HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SSO 法），由北京博富瑞基因診斷技術有限公司提供；人類白細胞抗原B*5801 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），人類白細胞抗原B*1502 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），人類白細胞抗原B*27 基因分型試劑盒（SSP 法），由江蘇偉禾生物科技有限公司提供；HLA-B27 基因檢測試劑盒（熒光PCR 探針法），由山東英盛生物技術有限公司提供；人類白細胞抗原B27 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 位點分型檢測試劑盒（SBT 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SSP 法），HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SSO 法），由賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供。人類白細胞抗原B27 核酸檢測國家參考品（批號：360035-201901，10 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國食品藥品檢定研究院提供；人類白細胞抗原B5801/5701/1502 核酸檢測國家參考品（批號：360036-201901，20 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國食品藥品檢定研究院提供；人類白細胞抗原組織配型基因分型國家參考品（批號：360045-202001，38 支/套，30 μL/支，20 ng/μL），由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.2 儀器

ABI 7500 熒光定量基因擴增儀由中國食品藥品檢定研究院提供；ABI GeneAmpPCR System，上海天能凝膠成像儀，由江蘇偉禾生物科技有限公司提供；luminex200 多功能流式點陣儀由北京博富瑞基因診斷技術有限公司提供；ABI 3730XL 分析儀由德必碁生物科技（廈門）有限公司提供；SLAN-96P 全自動醫用PCR 分析系統由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；Thermofisher DNA分析儀，Alpha Imager 凝膠成像系統由賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供。

1.2 方法

按照修訂后的行業標準《人類白細胞抗原（HLA）基因分型試劑盒》進行驗證。驗證的技術指標包括外觀、參考品符合率、重復性、有效檢測范圍、穩定性、準確性、特異性、檢出限。

1.2.1 外觀

目測檢查外觀，包括試劑盒的完整性、效期、包裝信息、是否有人為損傷。

1.2.2 與移植或輸血的供體與受體匹配相關試劑盒的性能要求

1.2.2.1 參考品符合率 對HLA 基因分型國家參考品或者企業參考品進行檢測，應與已知基因分型結果相符合。

1.2.2.2 重復性 將1～3 份具有代表性的DNA 樣品進行檢測，每份樣品平行檢測3～5 次，檢測的結果應一致且與已知基因分型結果相符合。

1.2.2.3 有效檢測范圍 用試劑盒檢測范圍內的陽性參考品，分別配制出最高和最低兩個濃度進行檢測，均應與已知基因型別相符合。

1.2.2.4 穩定性 可選用效期穩定性或熱穩定性試驗進行參考品符合率和有效檢測范圍項目的驗證。

1.2.3 疾病輔助診斷相關試劑盒的性能要求

1.2.3.1 準確性 對試劑盒檢測范圍內已知基因分型的國家或企業陽性參考品進行檢測，結果應為陽性或相應基因型。

1.2.3.2 特異性 對試劑盒檢測范圍外的國家或企業陰性參考品進行檢測，檢測結果應為陰性或未檢出。

1.2.3.3 重復性 對1～3 份陽性參考品平行進行檢測5～10 次，結果應均為陽性或相應基因型；對1～3 份陰性參考品平行進行檢測5～10 次，結果應均為陰性或未檢出。

1.2.3.4 檢出限 對檢出限參考品進行檢測，結果應為陽性或相應基因型。

1.2.3.5 穩定性 可選用效期穩定性或熱穩定性試驗進行準確性、特異性、檢出限、4 項目的驗證。

2 結果

2.1 外觀驗證結果

對6 家共16 批次HLA 基因分型檢測試劑盒，依據擬定HLA 行業標準的上述性能指標進行了全部驗證，所有試劑盒的各組份齊全、完整，液體無滲漏；包裝標簽應清晰，無磨損，外觀均符合行業標準規定。

2.2 與移植或輸血的供體與受體匹配相關試劑盒的性能驗證結果

2.2.1 參考品符合率驗證結果

3 家企業的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SBT 法和SSO 法）對人類白細胞抗原組織配型基因分型國家參考品的38 支人基因組DNA 樣品，全部進行參考品符合率檢測，在制造商宣稱的分辨率水平上，驗證結果與國家參考品已知基因分型結果相符合，結果均符合規定。

2.2.2 重復性和有效檢測范圍驗證結果

采用2 種方法學的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SSP 法和SSO 法），對3 份已知基因分型的具有代表性的重復性參考品進行檢測，每份樣品平行檢測3 次，檢測結果應一致，且在制造商宣稱的分辨率水平上與已知基因分型結果相符合。

對2 份試劑盒檢測范圍內已知基因分型的企業陽性參考品，分別配制出高、低2 個濃度后進行檢測，結果均在試劑盒制造商宣稱的分辨率水平上與已知基因型別相符合。

2.2.3 穩定性驗證結果

采用2 種方法學的HLA-A、B、C、DR、DQ 位點分型檢測試劑盒（SSP 法和SSO 法）對效期穩定性進行驗證，參考品符合率和有效檢測范圍均符合擬定行業標準的要求，見表1。

表1 與移植或輸血的供體與受體匹配相關試劑盒的部分驗證結果Table 1 Partial verification results of related kits matched with donors and recipients for transplantation or blood transfusion

2.3 疾病輔助診斷相關試劑盒的性能驗證結果

2.3.1 HLA-B27 基因檢測試劑盒的性能驗證結果

采用3 家共4 批次HLA-B27 基因檢測試劑盒（熒光PCR 法和SSP 法），對人類白細胞抗原B27核酸檢測國家參考品的10 支人基因組DNA 樣品全部進行了準確性和特異性檢測，試劑盒檢測范圍內已知基因分型的國家陽性參考品檢測結果均陽性或相應基因型。

試劑盒檢測范圍外的國家陰性參考品的檢測結果均為陰性；同時對2 家的企業陽性參考品和企業陰性參考品進行檢測，結果全部符合規定；重復性和檢出限項目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因檢測試劑盒（熒光PCR 法），對陽性重復性參考品平行進行檢測10 次，結果一致均為陽性，對陰性重復性參考品平行進行檢測10 次，結果一致應均為陰性，對檢出限參考品進行檢測結果均檢出陽性；穩定性項目中，采用2 家2 批次HLA-B27 基因檢測試劑盒（熒光PCR 法），對效期穩定性進行驗證，準確性、特異性和檢出限均符合擬定行業標準的要求，見表2。

表2 疾病輔助診斷相關試劑盒的部分驗證結果Table 2 Partial verification results of related kits for auxiliary diagnosis of diseases

2.3.2 HLA-B1502 和B5801 基因檢測試劑盒的性能驗證結果

在疾病輔助診斷相關試劑盒的性能要求中，采用1 家各1 批次的HLA-B1502 和B5801 試劑盒（PCR 法），對人類白細胞抗原B5801/5701/1502 核酸檢測國家參考品的20 支人基因組DNA 樣品全部進行了準確性和特異性檢測，試劑盒檢測范圍內已知基因分型的國家陽性參考品檢測結果均為陽性；試劑盒檢測范圍外的國家陰性參考品的檢測結果均為陰性；重復性和檢出限項目中，還采用1 批次HLA-B5801 試劑盒，對陽性重復性參考品平行進行檢測10 次，結果一致均為陽性，對陰性重復性參考品平行進行檢測10 次，結果一致應均為陰性，對檢出限參考品進行檢測結果均檢出陽性；穩定性項目中，還采用1 批次HLA-B5801 試劑盒對效期穩定性進行驗證，準確性、特異性和檢出限均符合擬定行業標準的要求。

3 討論

隨著體外診斷分子檢測技術的飛速發展和對HLA 科學研究的不斷深入，臨床上涌現出更多更豐富的HLA 基因分型試劑盒。從臨床預期用途來說，此類試劑盒主要有兩大類，一類是用于組織器官和干細胞移植供受體配型的A、B、C、DRB、DQB 位點的HLA 分型試劑，方法學上有低分辨率、中分辨率的SSP 法和SSO 法，還有高分辨率的SBT 法；另一類是用于疾病輔助診斷或臨床用藥指導的HLA 單位點核酸檢測試劑盒［10-11］，如與強制性脊柱炎密切相關的B27，與治療痛風常用藥別嘌呤醇過敏相關的HLA-B5801，與抗艾滋病經典藥物阿巴卡韋超敏反應相關的HLA-B5701，與抗癲癇藥卡馬西平藥物引起的史蒂芬瓊森癥候群相關的HLA-B1502 等基因檢測，這類試劑盒在方法學上主要以PCR 為主，包括熒光PCR 法、PCR 探針法、PCR 熔解曲線法等。

原行業標準YY/T 1180-2010 人類白細胞抗原（HLA）基因分型試劑盒（SSP 法）于2010年12月27日發布并于2012年6月1日實施，僅適用于SSP法檢測HLA 基因分型試劑盒，而該方法學的試劑盒主要用于HLA的I類A、B、C位點和Ⅱ類DRB、DQB位點的低分辨率、中分辨率的基因分型。為拓展行業標準的適用范圍，提高各類HLA 基因分型檢測試劑的產品質量，更好滿足監管需要，本次修訂標準時，根據HLA基因分型產品臨床預期用途和性能指標的不同，對產品指標做了分類。在技術指標的確定方面，參考了目前市場上進口企業和國產企業廠家相關產品的說明書和性能評估資料，并結合臨床要求制定，業內專家對逐條性能指標進行了充分討論。并且對標準中每一條性能指標和試驗方法均進行了實驗驗證，關鍵指標準確性和特異性采用了相應的HLA國家參考品［12-14］進行考察，如上所述，驗證結果全部符合標準規定的要求。綜上，修訂后的HLA 產品標準所列技術指標是合理的，所列試驗方法是可靠的可行的。