PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5在晚期乳腺癌放療過程中的動態表達及意義

寸倩瀅 張思榮 唐恩躍

作者單位：保山市人民醫院檢驗科，云南，保山678000

據統計，乳腺癌發生率居于全球范圍內女性惡性腫瘤首位，此類患者轉移后的5年生存率僅為27%甚至更低［1-2］。近年來，隨著放療技術進展，放療患者總體生存狀況得到顯著改善。但腫瘤在分子基因水平方面存在高度異質性，從而導致放療效果出現明顯差異［3］。程序性細胞死亡配體1（Programmed cell death ligand 1，PD-L1）通路在乳腺癌中存在活性，參與免疫介導的細胞凋亡［4］。人類白細胞抗原-B（Human leukocyte antigen-B，HLA-B）缺失表達是多種腫瘤發生的重要因素［5］。研究證實，腫瘤組織中存在多藥耐藥相關蛋白（Multidrug resistance associated proteins，MRP），其中MBP5 參與腫瘤發生進展，并與腫瘤復發有一定關系［6］。但關于三者在晚期乳腺癌放療過程中的監測價值仍缺乏循證依據。為此，本研究嘗試探究外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中PD-L1、MRP5、HLA-B 在晚期乳腺癌放療過程中的動態表達及意義。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取保山市人民醫院2018年1月至2021年1月122 例晚期乳腺癌患者，其中年齡平均年齡（52.17±7.61）歲；體質量指數平均（22.06±1.81）kg/m2；臨床分期：ⅢB 期72 例，Ⅳ期50 例。納入標準：均經病理檢查證實為乳腺癌；均具備放療指征；患者及家屬均知情，簽訂知情同意書。排除標準：參與本研究前接受抗腫瘤、免疫抑制治療者；伴有自身免疫性疾病者；存在急慢性嚴重感染者；妊娠期、哺乳期女性；合并血液系統疾病者。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有患者均行放療，采用直線加速器6 MVX射線與9 MEV 電子線，根據腫瘤分期、病理類型［7］等確定放療區域，照射劑量為2 Gy/次，5 次/周，總量直至50 Gy。以21 d 為1 個療程，共放療2 個療程。放療結束后4 周評估療效，腫瘤病灶完全消失，持續時間≥4 周為完全緩解；腫瘤病灶縮小幅度≥50%，且持續時間≥4 周為部分緩解；介于部分緩解與進展之間為穩定；腫瘤病灶增大幅度≥25%為進展。將完全緩解、部分緩解納入有效組，穩定、進展納入無效組［8］，分為有效組（74 例）與無效組（48 例）。

1.2.2 檢測方法

采集靜脈血30 mL，肝素抗凝，采用Hark's 液稀釋1 倍，緩慢加到NycoprepTM1.077A 人淋巴細胞分離液上，離心處理，2 000 r/min，離心20 min 離心半徑（13.5 cm），吸取中間白膜層，提取PBMC。采用Trizol 裂解PBMC，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用Real-time PCR Master Mix kit 進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測，引物由廣州伯信生物科技有限公司合成，反應條件：95℃60 s，95℃15 s，40 個循環，60℃60 s。采用△△Ct 法相對定量分析PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 表達量。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 處理數據，計量資料均確認具備方差齊性且近似服從正態布，以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用n（%）表示，χ2檢驗；相關性分析采用Spearman/Pearson 相關系數模型；預測價值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，獲取曲線下面積、置信區間、敏感度、特異度及截斷值，聯合診斷實施Logistic 二元回歸擬合，返回預測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較

放療1 個療程、放療結束后PBMC中PD-L1、MRP5mRNA水平低于放療前，HLA-BmRNA 高于放療前（P＜0.05）。見表1。

表1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD-L1，HLA-B and MRP5 mRNA in PBMC before and after radiotherapy（±s）

表1 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD-L1，HLA-B and MRP5 mRNA in PBMC before and after radiotherapy（±s）

注：與放療前比較，aP＜0.05。

組別放療前放療1 個療程放療結束后F 值P 值n 122 122 122 PD-L1 mRNA 1.48±0.22 1.27±0.18a 1.09±0.12a 146.477＜0.001 HLA-B mRNA 0.34±0.08 0.43±0.12a 0.52±0.15a 68.467＜0.001 MRP5 mRNA 5.12±0.67 4.56±0.52a 4.23±0.34a 88.742＜0.001

2.2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA及差值

有效組放療1 個療程、放療結束后PBMC中PD-L1、MRP5mRNA水平低于無效組，HLA-BmRNA水平高于無效組，放療前與放療結束后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 差值絕對值高于無效組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達量及差值比較（±s）Table 2 Comparison of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA and difference between two groups before and after radiotherapy（±s）

表2 兩組放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達量及差值比較（±s）Table 2 Comparison of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA and difference between two groups before and after radiotherapy（±s）

指標PD-L1 mRNA HLA-B mRNA MRP5 mRNA組別無效組有效組t 值P 值無效組有效組t 值P 值無效組有效組t 值P 值例數48 74 48 74 48 74放療前1.52±0.53 1.45±0.44 0.791 0.430 0.33±0.11 0.35±0.12 0.929 0.355 5.15±1.09 5.10±1.04 0.255 0.800放療1 個療程后1.42±0.47 1.18±0.63 2.261 0.026 0.35±0.12 0.48±0.16 4.816＜0.001 5.03±1.01 4.25±0.73 4.947＜0.001放療結束后1.35±0.45 0.92±0.21 7.122＜0.001 0.40±0.14 0.59±0.20 5.730＜0.001 4.76±0.94 3.88±0.61 6.276＜0.001放療前與放療結束后差值0.17±0.06 0.53±0.20 12.107＜0.001-0.07±0.03-0.24±0.08 14.078＜0.001 0.39±0.13 1.22±0.44 12.698＜0.001

2.3 PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 放療前與放療結束后差值相關性

Pearson 相關性分析，PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5mRNA水平放療前與放療結束后差值絕對值呈正相關（r=0.632、0.650、0.731，P均＜0.05）。

2.4 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 差值與療效的關系

Spearman 相關性分析，放療前與放療結束后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 差值絕對值與療效呈正相關（r=0.711、0.726、0.803，P＜0.05）。

2.5 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA水平差值對療效的預測價值

以無效組作為陽性樣本，有效組作為陰性樣本，繪制ROC 曲線，結果顯示，放療前與放療結束后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5mRNA 差值絕對值預測療效的AUC 分別為0.896、0.901、0.908，聯合預測療效的AUC 為0.951，95%CI 為0.906-0.996，敏感度為91.67%，特異度為91.89%，優于各指標單獨預測，見表3、圖1。

圖1 ROC 曲線圖Figure 1 ROC curve

表3 放療前后PBMC中PD-L1、HLA-B、MRP5 mRNA 表達量差值對療效的預測價值Table 3 the predictive value of PD-L1，HLA-B，MRP5 mRNA difference in PBMC before and after radiotherapy for curative effect

3 討論

近年來，臨床在乳腺癌篩查、治療及生存方面取得較大進展，但乳腺癌仍是45 歲以下女性最主要的癌癥死因。放療在減少乳腺癌術后復發、改善預后方面具有重要作用。但臨床實踐證實，即使臨床病理特征相同的乳腺癌患者在接受相同放療方案治療后，效果也會存在差異［9］。因此，在放療期間監測相關指標變化情況成為臨床預測放療效果、調整治療方案的重要途徑。

PD-L1 通路在多種癌癥中均扮演活躍的免疫檢查點的角色。PD-L1 作為一種跨膜蛋白，能夠結合活化細胞毒性T 細胞表面表達的PD-1 受體，阻滯T 細胞活化及下游信號轉導，抑制CD3/CD28 介導的T 細胞轉錄過程，從而促使腫瘤細胞逃避T 淋巴細胞的殺傷作用，進而加快腫瘤細胞生長、增殖。本研究發現，乳腺癌患者放療后PBMC中PD-L1mRAN 較治療前明顯下降，主要是由于PD-LI 通路在參與腫瘤發生發展過程中會引起葡萄糖代謝、蛋白激酶的激活、磷脂酰肌醇激酶的磷酸化等一系列生化反應，而放療過程中細胞代謝通路廣泛參與免疫識別與凋亡細胞的清除，導致PD-L1 表達下調［10］。乳腺癌腫瘤細胞會表達過多的PD-L1，降低其免疫原性，導致機體無法產生充足的抗腫瘤免疫效應，造成腫瘤細胞成功逃避宿主免疫系統監視，發生腫瘤免疫逃逸，而放療后腫瘤細胞被殺傷殺滅，PD-L1 表達便隨之下調［11］。故臨床可通過監測放療期間PD-L1 變化情況及早預測放療效果。

HLA-B 是HLA-Ⅰ類分子中最主要的因子之一，廣泛分布于所有有核細胞表面，此類因子屬于機體免疫的核心，不僅可參與免疫應答遺傳調控、調節全身免疫狀態，還是影響免疫識別的主要因素，在腫瘤發生時表達降低或缺失。Tevis SE 等［12］報道證實，乳腺間變性大細胞淋巴瘤患者HLA-B表達明顯減少，在腫瘤發生過程中發揮重要作用。本研究則表明，與放療前相比，乳腺癌患者放療后PBMC中HLA-BmRNA 明顯升高，且其放療前后的變化差值與放療療效密切相關。究其原因，PBMC 是重要的抗原遞呈細胞，宿主PBMC中HLA-B 的表達不僅代表的是宿主的免疫特性，還可呈現腫瘤特性，是細胞毒性T 細胞識別腫瘤細胞的關鍵，其表達量下調被認為是腫瘤細胞逃逸的重要機制之一［13］。因此，臨床可根據PBMC中HLA-B 表達情況評估患者機體細胞免疫情況及腫瘤特性，為制定個體化放療方案提供可靠依據。

報道顯示，炎癥除了是腫瘤發生的影響因素之外，還可改變藥物轉運蛋白表達及活性，促使腫瘤對放化療產生耐藥性，成為腫瘤放化療失敗的重要原因［14］。MPR5 是臨床常見的多藥耐藥相關蛋白之一，其表達上調可能是由于腫瘤患者外周血中的促炎介質與PBMC 表面相應受體結合的結果。在此基礎上，本研究結果顯示，PBMC中MPR5mRNA 放療后呈下降趨勢，其中放療無效組雖有下降但并不明顯，放療有效組下降較為顯著，出現這種現象的原因是放療雖可殺傷殺滅腫瘤細胞，但也會一定程度損傷正常細胞，破壞其細胞結構，導致促炎因子釋放并介導炎癥反應，激活NF-κB，釋放相關因子改變MRP5 活性功能與表達情況，并將輸入的抗逆轉錄病毒從細胞中泵出，從而引發耐藥效應［15］。提示監測其在放療過程中的變化情況是及早預測放療療效的重要途徑。

此外，在上述研究基礎上，本研究初次嘗試探究放療前后PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA差值聯合預測放療療效的價值，結果顯示，三者聯合預測的AUC 高達0.951，為臨床早期預測放療療效、調整放療方案提供新思路、新途徑，有利于提高療效，改善預后。但本研究屬于單中心、小樣本分析，可能造成數據偏移，需做進一步分析與探究。

綜上可知，晚期乳腺癌放療過程中動態監測PBMC中PD-L1、MRP5、HLA-BmRNA 變化情況能作為臨床預測療效的潛在途徑，有助于及時調整放療方案、提高療效。