JAK2 V617F基因突變及網織血小板數量在骨髓增殖性腫瘤并發血栓性疾病的研究

伏俊，任靜，昝春梅，嚴富天，李秀萼

(廣元市中心醫院，1.檢驗科；2.特檢科；3.病理科；4.廣元市中醫院婦產科，四川 廣元 628000)

骨髓增生性腫瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)是克隆性造血干細胞腫瘤，特征為一種或多種骨髓細胞的增殖。大多數疾病影響中老年人群，且發病率逐年增加，易與血栓形成、栓塞或重要器官梗死并發[1]。盡早發現栓塞并及時采取干預措施，對降低患者死亡率意義重大。隨著研究的深入，目前發現MPN與個體的遺傳學突變密切相關，而JAK2 V617F基因突變位點是目前MPN最為特征性的遺傳學突變。國內亦有研究[2]發現，JAK2 V617F突變陽性患者更易罹患血栓栓塞。目前，JAK2 V617F突變已被世界衛生組織( WHO)列為 BCR/ ABL陰性 MPN的主要診斷標準之一[3]。網織血小板由骨髓釋放，細胞漿內含有殘留RNA，反映骨髓血小板增生的速度[4]。AK2V617F基因位點突變與網織血小板相互結合的檢測方法對早期診斷MPN有一定的應用價值。本研究旨在探討JAK2 V617F基因突變及網織血小板計數與MPN并發血栓性疾病的相關性，為早期的干預治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2019年2月廣元市中心醫院收治的132例MPN患者為研究對象，是否并發血栓分為病例組(n=82)和血栓組(n=50)；另選40名同期體檢健康志愿者為對照組。病例組中，男性43 例，女性39 例；年齡31.6～75.3 歲，平均(44.7±4.6)歲。血栓組中，男性27例，女性22例；年齡32.8～77.5歲，平均(45.5±4.0)歲；對照組中，男性22名，女性18名；年齡31.4～75.9歲，平均(45.0±3.7)歲。本研究經院倫理委員會批準，所有對象知情同意。三組對象性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)根據“世界衛生組織(WHO)相關MPN 新診斷標準”確診的患者，包括以下8種類型：慢性髓性白血病BCR/ABL1陽性(CML)、真性紅細胞增多癥(PV)、原發性血小板增多癥(ET)、原發性骨髓纖維化(PMF)、慢性中性粒細胞白血病(CNL)、慢性嗜酸性粒細胞白血病非特質型(nototherwisespecified，CEL)、肥大細胞增多癥(mastocytosis)、骨髓增殖性腫瘤未分類型(MPN-U)；(2)年齡>18 歲；(3) 血栓事件經計算機斷層掃描、磁共振成像、數字減影血管造影或彩色多普勒超聲證實，并由家進一步診斷；(4) 臨床資料完整。排除標準：(1)其他類型血液惡性疾病，如原發白血??；(2)其他引起血栓事件的疾病，如骨科手術、妊娠、房顫；(3)嚴重肝腎腦肺心等臟器功能障礙。

1.2 方法

1.2.1 網織血小板檢測 采集研究對象ETDA-K3抗凝全血3 mL，顛倒混勻 5～8 次，采用邁瑞BC- 6900自動血液分析儀檢測網狀血小板計數，試劑、質控和校準品均為配套(M-68FD染色液批號：2019101404等)。

1.2.2 JAK2V617基因突變檢測 (1)DNA提取：采用西安天隆全血基因組DNA提取試劑盒(批號：E01888070251等)提取， 操作嚴格按試劑盒說明書進行。(2)PCR檢測：引物由上海之江生物合成，引物物序列為P5’- CCTCAGAACGTTGATGGCA-3’，P2r5’- ATTGCTTTCCTTTTTCACAACA-3’，Pnf5’-AGCATTTGGT TTTAAATTATGGAGTATATG-3’ 和Pmr5’-GTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3’。擴增條件：95 ℃反應30 s、54 ℃反應25 s、72 ℃反應30 s，共40個循環，最后72 ℃反應10 min 結束。PCR產物經2.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，產物為453 bp、279 bp (JAK2V617F 突變等位基因) 和 229 bp(野生型等位基因)。所有的實驗室檢測均在廣元市中心醫院檢驗科由具備相應資質的實驗室老師完成，實驗中所采購和使用的試劑均經過CFDA批準。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 三組網織血小板計數及JAK2V617基因突變陽性率比較

三組網織血小板計數及JAK2V617基因突變陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組。見表1。

表1 三組對象網織血小板計數及JAK2V617基因突變陽性率比較

2.2 網織血小板計數及JAK2V617基因突變與血栓形成的相關性

相關性分析顯示，網織血小板計數及JAK2V617基因突變與血栓形成呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 網織血小板計數及JAK2 V617 基因突變與血栓形成的相關性

3 討論

隨著MPN患者數量的增加，且大多數涉及中老年人，容易出現血栓形成、栓塞或重要器官梗塞等并發癥[5]。血小板是由骨髓成熟的巨核細胞所產生，而網織血小板是巨核細胞轉化為血小板過程中的一個幼稚階段，可以反映骨髓血小板增生的速度。本研究結果顯示，三組對象網織血小板計數比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組，與既往研究[6-7]結果一致，表明MPN患者存在血小板的異常增生，而血小板增多，會導致血液的凝固性增高，易誘發血栓的形成。

半個多世紀以來，通過對骨髓增殖性腫瘤持續研究，除了發現染色體 [t(9.22)(q34；q11)]形成 BCR/ ABL融合基因是MPN特異的分子標記外，而在BCR/ ABL陰性患者(如 ET， PMF)中尚未發現類似的特征性分子生物學指標，也沒有發現MPN早期診斷特異性較強的生物學指標，而Baxter等在2005年文獻首次發現Janus kinase(JAK)2基因V617F突變存在于MPN患者，成為了此病研究的一大突破[8]。JAK2具備，通過對白細胞介素-3、巨噬細胞集落刺激因子、促血小板生成素、促紅細胞生成素、生長因子等多種細胞因子的信號傳導調節、促進細胞增殖[9]。多數學者[10]認為，下游相關信號轉導分子表達異常是JAK2 基因突變后的主要繼發事件，可使一系列細胞產生過度增生，分別向粒細胞、巨核細胞、紅細胞分化，最終誘發MPN、血栓病變。在各種造血生長因子受體的信號轉導與JAK2V617基因的突變率及網狀血小板的生成狀態有著緊密的聯系，或可促進或調節造血細胞的増殖[11]。本研究結果也顯示，三組JAK2V617基因的突變率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且血栓組>病例組>對照組。相關性分析顯示，網織血小板計數及JAK2 V617F突變的陽性率呈正相關(P<0.05)，表明網織血小板升高及JAK2V617F突變的陽性率增加，MPN患者發生血栓的風險更大。本研究的不足在于所收集的病例較少，且僅針對的疾病種類有限，今后將進一步擴大樣本量，分析JAK2V617基因在多種血液病的突變狀況。

綜上，MPN患者并發血栓性疾病與網織血小板計數及JAK2 V617F 基因突變有一定的相關性，可能成為評估MPN患者血栓早期發生的實驗室檢查手段。