基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術靶向敲除OsFAD2 創制高油酸水稻突變體

任代勝，劉 浩，喬保建

（1.安徽袁糧水稻產業有限公司，安徽 蕪湖 241003；2.廣東省農業科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】水稻是我國重要的糧食作物，在日常飲食中作為主食為人體能量代謝提供碳水化合物。由于我國人口基數大，過去糧食供應緊缺，傳統的育種與栽培觀念更傾向于提高水稻的總產量［1］。但隨著時代的變化，改變稻米及其副產品的營養品質成為新的目標。稻谷在加工過程中被去除的碎屑組織稱為米糠或米粕，富含脂肪酸、氨基酸、花青素、多酚等物質［2］，所提取的米糠油含有脂肪酸組分、維生素E、甾醇、谷維素等有利于人體吸收的營養成分，吸收率高達90%，并具有清除血液中的膽固醇、降低血脂等保健作用［3］。因此，提高并改良稻米油的營養組分對產業發展具有重要意義。

【前人研究】米糠油中棕櫚酸約占總油脂的15%，硬脂酸含量小于3%，油酸約為45%，亞油酸變化幅度較大約為29%～42%，亞麻酸含量小于1.8%。油酸分子為18 碳烯酸，因第9 位與第10位碳原子間存在雙鍵而形成單不飽和脂肪酸。油酸含量較高的植物油對人體健康較為有益，長期食用可降低心腦血管發病率，增強人體免疫力［4］。此外，油酸分子的18 碳長鏈中僅含有單個碳-碳不飽和雙鍵（C=C），其化學分子式結構穩定可提高油品的抗氧化能力、延長油品存儲期，因此植物高油酸育種是產業化發展的主攻方向。目前油酸合成的分子機制已經明確，脂肪酸脫飽和基因FAD2（Fatty Acid Desaturase 2）位于油酸合成通路的下游，該基因突變后阻斷油酸向亞油酸轉化，進而提高油酸含量［5］。基于此原理，通過選育含有fad2的品種是植物高油酸育種的主要策略。木本油料作物中橄欖油與山茶油的油酸含量可占總油脂的90%以上，豆科植物中大豆與花生的高油酸品種可達70%，并且高油酸育種已經在油菜、向日葵等大宗油料作物中廣泛開展。以水稻為代表的禾本科作物僅高油酸胚芽油有少量報道，但也只限于基礎研究層面，鑒于缺少可利用的高油酸種質資源，產業化應用仍然相當落后。

【本研究切入點】傳統育種獲得突變體材料主要依靠誘變育種，而目標個體篩選卻費時費力。CRISPR/Cas9 基因編輯技術是通過設計靶向位點引導sgRNA 與CRISPR/Cas9 蛋白相融合，對目的基因DNA 序列進行特異性剪切，然后機體通過非末端同源重組修復受損的序列，導致核酸序列錯配、插入、缺失以實現目標基因突變［6］。有關利用CRISPR/Cas9 技術靶向OsFAD2及其旁系同源基因的研究鮮有報道，這限制了對油酸調控基因功能的了解。【擬解決的關鍵問題】本研究以水稻OsFAD2為目的基因，通過CRISPR/Cas9 基因編輯與轉基因技術相結合，獲得水稻高油酸突變體材料。研究結果可為后續開展水稻高油酸育種提供新的種質資源，并為稻米油產業發展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻材料為日本晴種子，由安徽袁糧水稻產業有限公司提供。供載體構建轉化的大腸桿菌菌株為DH5α，供水稻遺傳轉化的土壤膿桿菌菌株為EHA105，由廣東省農業科學院作物研究所提供。OsU6a-sgRNA 表達盒載體與pYLCRISPR/Cas9 由華南農業大學劉耀光院士課題組饋贈。BsaⅠ限制性內切酶與T4 DNA 連接酶購于NEB（New England Biolabs）有限公司，瓊脂糖凝膠核酸純化回收試劑盒為OMEGA 凝膠回收試劑盒D2500-01，反轉錄cDNA 試劑盒為TOYOBO FSK-100，熒光定量PCR 試劑為ThermoFisher 公司的Fast SYBR Green Master Mix，脂肪酸檢測試劑購于Sigma-Aldrich 公司。熒光定量PCR 儀由華南農業大學國家植物航天育種工程技術中心提供，GC-MS 連用儀由華南農業創新中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1OsFAD2-sgRNA表達盒載體構建OsFAD2基因組序列參考MSU Rice Genome Annotation Project數據庫公布的基因登錄號LOC_Os02g48560。sgRNA表達盒以Amp抗性的pUC18載體為骨架經改造而來，大小約為3 kb。利用 CRISPRGE［7］網站設計OsFAD2的敲除靶點，該靶點為20 bp序列，位于第一外顯子靠近起始密碼子的位置，由Intervitrogene公司以引物的形式進行合成。OsFAD2-sgRNA表達盒構建，利用PCR儀設置95 ℃處理靶點接頭引物（前引物：GCCGGAGGAGCAGAAGCTGCT，后引物：AAACAGCAGCTTCTGCTCCTC）30 s，用T4 DNA連接酶將靶點接頭引物與BsaⅠ酶切后的pYLCRISPR/OsU6a-sgRNA載體相連，利用特定載體引物（前引物：CTCCGTTTTACCTGTGGA ATCG，后引物：CGGAGGAAAATTCCATCCAC）擴增OsU6a-FAD2-sgRNA序列，PCR產物切膠純化后備用。

1.2.2 單靶點pYLCRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA載體構建 利用BsaⅠ酶切載體pYLCRISPR/Cas9-FAD2-sgRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切載體片段，切膠純化回收。再利用BsaⅠ單酶切OsU6a-FAD2-sgRNA 的PCR 產物，充分酶切后直接利用Omega DNA 純化試劑盒回收酶切產物，全部線性化的純化片段利用 T4 連接酶于20 ℃連接2 h 后，將10 μL 連接產物加入到100 μL 的DH5α 大腸桿菌感受態細胞于42 ℃進行熱激法轉化。陽性克隆子鑒定采用天根質粒小提試劑盒提取大腸桿菌質粒DNA，利用AscⅠ酶切進行驗證，陽性克隆經Sanger 測序后確定Cas9-FAD2-sgRNA 載體構建成功［8］。

1.2.3OsFAD2敲除植株的轉基因構建 將構建的Cas9-FAD2-sgRNA 載體轉化土壤膿桿菌，含有陽性載體的農桿菌菌株侵染日本晴的愈傷組織，共培養3 d 后，轉移侵染后的愈傷于潮霉素抗性培養基篩選2 次共40 d，愈傷再經過分化、生根獲得轉基因再生植株。采用CTAB 法提取轉基因水稻葉片基因組DNA，在距離靶點上下游約200 bp 的位置設計引物，通過PCR 反應與Sanger測序鑒定靶點序列突變情況，并將陽性植株（T0代）練苗后栽至溫室，所產生的種子繼續栽種至T1代［9］。

1.2.4OsFAD2表達量檢測 取0.1 g 葉片經液氮研磨，加入1 mL Invitrogene 的TRIZOL 試劑靜置；加入300 μL 氯仿，13 000 r/min 離心5 min，取上清液400 μL 并加入等體積異丙醇，13 000 r/min離心5 min，70%無水乙醇洗滌，DEPC 水溶解總RNA。取1 μg 總RNA，利用反轉錄試劑盒FSK-100 獲得全長cDNA，以此作為模版，采用ABI StepOne Plus 系統，使用SYBR Premix ExTaq 進行熒光定量PCR 檢測，反應體系為20 μL，用2-ΔΔct法計算目標基因各組織的相對表達量，以野生型日本晴植株作為對照［10］。

1.2.5OsFAD2敲除植株籽粒脂肪酸組分檢測脂肪酸檢測所用試劑，包括脂肪酸標品（Sigma-Aldrich）、三氯甲烷（Sigma-Aldrich）、甲醇（色譜純）、石油醚、乙醚、氫氧化鉀，所用儀器為安捷倫GC-MS 氣質聯用儀7890A+5975C，色譜柱為DB-225MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣量1 μL，氣化溫度280 ℃，分流比10 ∶1，載氣為氦氣（99.999%），流量1 mL/min，柱溫初始溫度50 ℃，5 ℃/min 升溫至200 ℃，2 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。色譜條件依次檢測各標準溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算得到各種標準曲線。稱取水稻籽粒研磨后0.2 g 樣品，加入0.5 mL 石油醚一乙醚混合液，渦旋振蕩、靜置1 h，4 000 r/min 離心1 min，加入0.25 mL氫氧化鉀一甲醇溶液為甲酯化試劑，渦旋振蕩、靜置1 h，再次渦旋振蕩，加入0.5 mL去離子水，靜置30 min 分層、以4 500 r/min 離心2 min、取上清液，供氣相色譜質譜聯用儀測定。對樣品質譜峰圖與標準品峰圖進行比對，計算各組分相對含量［11］。

2 結果與分析

2.1 水稻OsFAD2 基因與蛋白序列特性分析

水稻OsFAD2（LOC_Os02g48560）位于第2條染色體上，基因序列5 244 bp，僅含有1 個外顯子區段，該基因的信使RNA 同時包含3 種可變剪切形式，大小分別為1 359、1 166、1 148 bp（圖1A）。其中可變剪切轉錄本OsFAD2-1的蛋白序列長度452 個氨基酸，在72～137 aa 處含有保守的DUF3474 結構域，在155～416 aa 處含有脂肪酸脫飽和酶結構域；OsFAD2-2與OsFAD2-3蛋白序列長度相似，僅有少量氨基酸缺失差異，兩者分別在18～73 aa 與85～353 aa 處含有保守的DUF3474 與脂肪酸脫飽和酶結構域（圖1B）。由此推測，雖然OsFAD2具有3 種不同的可變剪切轉錄本，但是所編碼的蛋白均含有保守的脂肪酸脫飽和酶結構域，該保守區段可能是其促進油酸脫氫后產生亞油酸的主要結構。

圖1 OsFAD2 基因與蛋白結構示意圖Fig.1 Schematic gene and protein structures of OsFAD2

2.2 OsFAD2 組織表達量分析

為明確OsFAD2能否在種子內具有表達活性，利用RiceXPro數據庫［12］檢索OsFAD2基因表達量，數據經過整合重新分析后發現，OsFAD2在營養生長階段的表達量以在葉片中最高，其次是葉鞘，在莖與根中表達量較低，表明該基因在地上部分組織的表達水平整體高于地下部分。而進入生殖生長階段，該基因在種子內稃中的表達量最高，而在受精后胚以及胚乳中的表達量略高于花序、花藥、雌蕊和子房，總體而言在種子發育過程中的表達量要高于營養生長階段葉片的表達量（圖2），表明該基因對于籽粒積累脂肪酸的調控有重要的生物學功能。組織表達量分析也明確了該基因的潛在功能，若該基因不能在水稻籽粒發育階段表達，則后續開展CRISPR/Cas9 基因敲除將失去實際意義。

圖2 OsFAD2 在不同組織內的基因表達模式分析Fig.2 Analysis of gene expression pattern of OsFAD2 in different tissues

2.3 CRISPR/Cas9 誘導的OsFAD2 敲除植株檢測

針對OsFAD2基因3 個可變剪切的共有序列設計CRISPR/Cas9 敲除的單個靶點，該引導RNA的位置位于編碼區距離起始密碼子（ATG）250 bp 處。最終構建好的Cas9-FAD2-sgRNA 經酶切與測序驗證表明，FAD2-sgRNA 表達盒與玉米泛素化啟動子Ubi 驅動的Cas9 蛋白連接成功（圖3A）。

利用農桿菌介導法將表達載體轉入日本晴的愈傷組織，以30 個長勢良好的愈傷組織團聚體作為外植體進行轉染，經潮霉素抗性標記篩選后獲得17 株轉基因再生苗。其中4 株為白化苗且未能存活，5 株未能產生突變，剩余8 株的OsFAD2序列均有堿基突變，總體轉化效率接近50%，可見該類載體的編輯效率非常高。經過序列比對后，最終確定了3 個獨立的轉基因T0代植株，命名為fad2-1、fad2-2、fad2-3。T0代轉基因植株測序結果表明，fad2-1同時存在缺失與堿基替換，fad2-2在靶點位置均為堿基替換，fad2-3有1 個位點發生堿基缺失，其余均為堿基替換類型。由于T0代植株屬于嵌合體，因而與野生型植株相比在進行測序時，峰圖均存在雙峰現象，該結果屬于正常現象（圖3B）。同時，利用CRISPR-GE網站預測所設計靶點的潛在脫靶基因，篩選發現有10 個基因的編碼區序列可能是潛在的敲除位點，經序列檢測后發現，fad2-1不存在脫靶現象，而fad2-2與fad2-3均有脫靶現象（表1），表明fad2-1可作為陽性植株開展后續脂肪酸檢測試驗。

表1 CRISPR-GE 預測的脫靶基因信息Table 1 List of off-target genes predicted by CRISPR-GE

本試驗收獲3 個獨立T0代株系的種子，進行擴繁得到T1代植株，但檢測T1代植株靶點時發現，fad2-2與fad2-3產生的種子后代在敲除靶點全部變為正常序列，原本T0代的變異序列被同源重組修復后變成了與野生型一致的序列，加之該兩個株系存在脫靶現象，因此不可作為后續試驗材料。而fad2-1在敲除靶點存在3 個堿基缺失與堿基替換現象，表明fad2-1為純合株系，并且測序峰圖并未出現嚴重的雙峰現象（圖3C）。熒光定量PCR 檢測fad2-1兩個獨立株系的OsFAD2基因表達量，結果顯示該基因的表達量顯著低于野生型內的表達水平（圖3D），可見本研究獲得了穩定性遺傳的CRISPR/Cas9 敲除OsFAD2的轉基因植株。

圖3 OsFAD2 的CRISPR/Cas9 敲除植株驗證Fig.3 Validation of OsFAD2 knock-outed plants via CRISPR/Cas9

2.4 OsFAD2 轉基因敲除植株籽粒的脂肪酸組分檢測

經驗證明確fad2-1為陽性敲除植株后，我們收獲了兩個獨立株系的轉基因種子，利用GC-MS氣質聯用儀檢測脫殼后種子的脂肪酸含量，結果表明，棕櫚酸（C16∶0）含量在fad2-1中略有減少，但是單不飽和棕櫚酸（C16∶1）含量有所增加；18 碳長鏈脂肪酸中的硬脂酸（C18∶0）含量雖在敲除植株中有所減少，但該類脂肪酸總體含量較少，未達到顯著差異；油酸（C18∶1）含量則明顯發生變化，其含量顯著高于野生型中的含量，而相應的亞油酸（C18∶2）含量則出現顯著下降，亞麻酸（C18∶3）含量總體變化不大（圖4）。通過種子脂肪酸組分含量檢測可以確定，OsFAD2突變后對油酸含量的增加有顯著促進作用。本研究通過利用CRISPR/Cas9 敲除OsFAD2獲得了穩定遺傳的高油酸稻突變體材料。

圖4 OsFAD2 敲除突變體植株種子的脂肪酸組分檢測Fig.4 Detection of fatty acid composition in OsFAD2 knock-outed mutants

3 討論

CRISPR/Cas9 基因定點編輯技術具有突變效率高、載體構建簡便的優勢，是水稻種質資源創新的前沿技術，與傳統獲得突變體的方式不同，通過靶向引導RNA 的介入，CRISPR/Cas9 蛋白酶可對DNA 序列進行高效剪切，機體的非同源重組修復再產生多種類型的堿基變異模式［13］。而后續通過雜交或輪回選擇的方式可剔除內源性插入的CRISPR/Cas9 蛋白的編碼序列與篩選標記，該技術與傳統育種方式的有效結合可構建水稻基因突變體庫［14］。本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術對水稻脂肪酸脫飽和酶基因OsFAD2編碼區序列進行定點編輯，獲得了能夠穩定遺傳的高油酸種質材料，為后續開展高油酸水稻育種奠定了基礎。

OsFAD2在水稻體存在4 個同源基因，本研究主要針對OsFAD2-1（LOC_Os02g48560）進行研究，其他3 個同源基因如OsFAD2-2（LOC_Os07g23430）、OsFAD2-3（LOC_Os07g23410）、OsFAD2-4（LOC_Os07g23390）均被預測定位于第7 條染色體上，三者是否具有與OsFAD2-1類似的功能仍有待深入研究，若采用CRISPR/Cas9 基因編輯創制三者的突變體，則能夠有效解釋水稻OsFAD2及其同源基因之間的功能冗余性問題［15］。此外，OsFAD2突變體不僅能夠被應用于實際育種工作，還可以作為基礎研究材料用于研究水稻脂肪酸合成代謝的分子機制。此前有研究報道OsFAD2-1的RNAi 干擾植株可表達生成高油酸米糠油，米糠油具有較高的氧化穩定性，無需加氫過程而直接被用于食品工業［16］。敲減OsFAD2-1基因表達會伴隨脂質合成通路中多個關鍵基因表達下調，表明該基因能夠在整體水平上影響種子脂肪酸的合成［17-18］。本研究鑒定到敲除OsFAD2導致該基因喪失表達能力，可顯著提高油酸含量，并且發現單不飽和棕櫚酸（C16∶1）含量有所增加，該結果與花生中高油酸突變體結果類似，花生FAD2突變后也可以提高C16∶1 含量［19］，但具體機制仍有待深入研究。因此，利用OsFAD2突變體可為水稻脂肪酸合成代謝研究提供新的切入點。

我國是水稻生產大國，每年總產量約2 億t，米糠等副產品的產量約占6.5%，粗略估計如充分利用可產稻米油180 萬t，相當于1 000 多萬t 大豆的含油量，可緩解食用油供給壓力［20］。隨著我國稻米精深加工業整體水平的提高，以及人們對油類產品營養保健作用的重視，米糠油的產業鏈正在逐步發展壯大。油酸含量較高的植物油營養價值、貨架存儲期均優于普通植物油，現已成為衡量植物油價格高低的評價標準，例如橄欖油、山茶油等價格是普通植物油的5～10 倍［21］。因此，大力推廣高產、高油酸水稻品種能夠促進稻米油產業全面發展，本研究所創制的高油酸水稻種質資源則具有潛在的產業應用價值。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得OsFAD2的突變體材料，為水稻高油酸育種提供了新的種質資源。通過水稻全生育期基因轉錄表達量分析發現，OsFAD2的表達量在生殖生長階段顯著高于營養生長階段，表明該基因可調控籽粒中的油酸合成。鑒于CRISPR/Cas9 基因編輯可特異性敲除目標DNA 序列，本研究所設計的敲除靶點位于OsFAD2起始密碼子（ATG）下游約250 bp 處，因此創制出新OsFAD2突變類型。其遺傳特性穩定的T1代轉基因植株油酸含量比野生型植株提高了25%～30%，而種子亞油酸含量相應減少約35%，該結果表明通過靶向敲除OsFAD2的編碼序列，可有效改良水稻油酸及其他脂肪酸的組成。