紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產消化酶生產工藝優(yōu)化

李紅勝，邢宏博，許贛榮，倪冬姣,2，鄒新華,2，宋漢良，宋 敏，肖小云

（1.佛山播恩生物科技有限公司，廣東 佛山 528100；2.農業(yè)農村部生物飼料國家重點實驗室，江西 贛州 341000）

【研究意義】紅曲菌（Monascus）又稱紅曲霉，是一類小型絲狀腐生真菌。在我國，由紅曲菌發(fā)酵制得的紅曲在食品著色和藥用方面已有1 000 多年使用歷史［1］。紅曲具有活血化瘀、健脾消食、降血脂、降血壓等功效。紅曲的藥用價值與紅曲菌固態(tài)發(fā)酵所產生的紅曲色素、莫納可林K（Monacolin K）、麥角固醇、γ-氨基丁酸以及各種酶類、有機酸等次級代謝產物有著密切關系，紅曲菌消化酶就是其中具有應用價值的成分之一。目前，飼料工業(yè)用酶制劑主要由芽孢桿菌類、曲霉類等菌株生產，已工業(yè)化生產并運用的有植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖化酶等。紅曲菌在生長代謝過程中會產生多種酶類物質，對其合理利用能有效促進動物消化吸收、提高飼料利用率、促進動物生長、預防疾病等［2-5］。【前人研究進展】已有研究表明，大部分紅曲菌都可以產生活性較高的蛋白酶，蛋白酶能將蛋白質水解成氨基酸、多肽等小分子化合物，利用這一特性，紅曲菌在腌漬魚肉、豆腐乳等高蛋白食品的生產加工中運用較為廣泛。我國民間用紅糟（紅曲菌培養(yǎng)物）腌漬后的肉制品顏色鮮艷、肉質鮮嫩且風味獨特［6］。紅曲中的淀粉酶及糖化酶幾乎能將淀粉完全水解成葡萄糖，利用紅曲菌這一特性生產葡萄糖，比采用酸水解法生產葡萄糖具有原料利用率高、成本降低、成品質量高等優(yōu)點。我國浙江、福建和臺灣等省利用紅曲中的淀粉酶、糖化酶作為糖化發(fā)酵劑釀制的紅曲酒遠近馳名。目前紅曲消化酶主要用于肉制品行業(yè)和釀造行業(yè)，產品有紅曲酒、紅曲醬油、紅曲醋、紅曲腐乳等［7-9］。【本研究切入點】常規(guī)單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件費時耗力，且未考慮變量間的交互作用。響應面分析采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，能夠綜合評價一組變量與響應值（因變量）的關系，可用于優(yōu)化發(fā)酵條件。【擬解決的關鍵問題】本試驗對紅曲菌產消化酶類的生產工藝進行研究，利用響應面法優(yōu)化紅曲菌產液化酶、糖化酶、蛋白酶的發(fā)酵條件，為紅曲菌在飼料工業(yè)的運用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試7 株紅曲菌為實驗室保存菌株，包括紅色紅曲菌9901、叢毛紅曲菌9908、紅色紅曲菌9909、紫色紅曲菌W1、紫色紅曲菌ZH2、紫色紅曲菌ZH6 和紫色紅曲菌SJS-6。

PDA 瓊脂斜面培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，切塊，加水800 mL 煮沸30 min，經(jīng)8 層紗布過濾，用雙蒸水定容至1 000 mL，向濾液中加入20 g 葡萄糖、20 g 瓊脂，融化后倒入試管。115℃滅菌15 min，滅菌后放置斜面。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L，蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，玉米漿粉6 g/L。121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：廣西秈米50 g，加適量雙蒸水滅菌冷卻。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種斜面制備 將在4 ℃冰箱保藏的菌種置于30 ℃恒溫箱中活化24 h，在超凈工作臺中將菌種轉接至新鮮PDA 斜面上，然后放入30℃恒溫箱中培養(yǎng)8 d。

1.2.2 孢子懸浮液制備 在超凈工作臺中用無菌水將菌種孢子從斜面洗脫下來，制成孢子濃度為1×106個/mL 的孢子懸液，用于接種。

1.2.3 液態(tài)種子培養(yǎng) 取上述孢子懸液按一定比例接種至裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在30 ℃、170 r/min 的旋轉式搖床中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的液態(tài)種子按一定比例（最佳為25%）接種至裝有50 g 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于生化培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.5 單因素試驗 分別對發(fā)酵時間（2、4、6、8、10 d）、加水量（30、35、40、45、50 mL）、接種量（15%、20%、25%、30%、35%）、發(fā)酵溫度（25、27.5、30、32.5、35 ℃）進行紅曲菌發(fā)酵產消化酶試驗，以發(fā)酵產物中糖化酶、液化酶及蛋白酶的活性為指標，確定各因素的最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗 利用統(tǒng)計分析軟件Minitab15 版進行試驗設計和數(shù)據(jù)分析。在單因素試驗基礎上，分別以加水量、接種量、發(fā)酵溫度為自變量，以紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性為因變量進行響應面優(yōu)化。

1.3 消化酶活性檢測

1.3.1 液化酶 取1.000 g 烘干后粉碎的紅曲米加水18 mL、pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液2 mL，于40 ℃恒溫水浴1 h，期間20 min 震蕩1 次，用慢性濾紙過濾備用。液化酶活力的測定采用分光光度法［10］。1 mL 酶液在40 ℃下1 h 水解1 mg淀粉為1 個活力單位。

1.3.2 糖化酶 取1.000 g 烘干后粉碎的紅曲米加水18 mL、pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液2 mL，于40 ℃恒溫水浴1 h，期間20 min 震蕩1 次，用慢性濾紙過濾備用。糖化酶活力的測定采用DSN法［11］。1 mL 酶液在40 ℃下水解可溶性淀粉生成1 mg 葡萄糖為1 個活力單位。

1.3.3 蛋白酶 參照國家標準GB/T 23527-2009蛋白酶制劑，采用福林-酚試劑法［12］測定蛋白酶活性。1 mL 酶液在40 ℃下水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸為1 個活力單位。

2 結果與分析

2.1 7 株紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性比較

從圖1 可以看出，不同菌株的代謝產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性存在較大差異，這可能與不同菌株代謝途徑存在一定差異有關。7 株紅曲菌中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性最高的菌株均為紫色紅曲菌ZH6。蛋白酶又分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶。從圖1 可知，7株紅曲菌所產生的蛋白酶均在酸性條件下活性最高。這可能與紅曲菌嗜酸特性有一定關系，在堿性條件下蛋白酶受到一定損傷，因此紅曲菌產生的蛋白酶活性在酸性條件下最高［13］。因此后續(xù)試驗選取紫色紅曲菌ZH6 分別對紅曲發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶活性作進一步研究。

圖1 不同紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性比較Fig.1 Comparison of digestive enzyme activities in solidstate fermentation product of different Monascus strains

2.2 紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產消化酶單因素試驗結果

2.2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產物中消化酶活性的影響固定加水量為40 mL、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為20%，研究發(fā)酵時間對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖2 可以看出，發(fā)酵時間對紫色紅曲菌ZH6 發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性均有較大影響。隨著發(fā)酵時間的增加，代謝產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性先增高后降低，這可能是由于在發(fā)酵前期菌體大量繁殖同時需要較多營養(yǎng)物質，底物消耗較快，因此隨著菌體生長繁殖產生大量消化酶，但發(fā)酵后期由于底物大量消耗已不能滿足菌體生長需要而進入衰亡期，導致酶活降低且底物消耗速率減緩。紫色紅曲菌ZH6 液化酶的最適發(fā)酵周期為6 d，而糖化酶的最適發(fā)酵周期為10 d，這可能是由于淀粉在酶解過程中分為糖化和液化兩個過程，在淀粉酶解過程中液化酶通過酶解將淀粉分解為糊精及低聚糖，而后由糖化酶將其水解為葡萄糖。酸性蛋白酶在發(fā)酵8 d 時酶活達到最高。

圖2 發(fā)酵時間對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性的影響Fig.2 Effects of fermentation time on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.2 加水量對發(fā)酵產物中消化酶活性的影響選用水分含量為8.8%的大米作為固態(tài)發(fā)酵基質，固定接種量為20%、培養(yǎng)溫度為30℃、發(fā)酵時間為7 d，分別加水30、35、40、45、50 mL，研究加水量對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖3 可以看出，固態(tài)發(fā)酵基質的加水量對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性具有一定影響。當紅曲菌固態(tài)發(fā)酵基質中加水40 mL（即初始水分含量為49.33%）時，液化酶活性達到最高；當加水45 mL（即初始水分含量為52%）時，糖化酶活性達到最高；當加水35 mL（即初始水分含量為46.35%）時，酸性蛋白酶活性達到最高。因此，同一菌株對不同代謝產物的最適水分含量也不同。

圖3 加水量對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性的影響Fig.3 Effect of water addition on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.3 接種量對發(fā)酵產物中消化酶活性的影響固定加水量為40 mL、培養(yǎng)溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為7 d，分別接種15%、20%、25%、30%、35%研究接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖4可以看出，接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶的活性均有一定影響，隨著接種量的增加，各酶活性先增加后降低，當接種量為20%時，液化酶及酸性蛋白酶活性達到最高；當接種量為25%時，糖化酶活性達到最高。

圖4 接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.4 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產物中消化酶活性的影響紅曲菌生長適宜的溫度范圍較廣，可在15～42 ℃生長。固定加水量為40 mL、接種量為20%、發(fā)酵時間為7 d，分別在25、27.5、30、32.5、35 ℃培養(yǎng)，研究培養(yǎng)溫度對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖5 可以看出，發(fā)酵溫度對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶的活性均有一定影響。25～30 ℃時，隨著溫度升高酶活性升高；30～35 ℃時，隨著溫度繼續(xù)升高酶活性反而降低。這可能是由于隨著溫度升高酶活性相對較高，菌體生長較快，從而產生大量酶；但超出一定溫度范圍后，生長過快的菌體在發(fā)酵后期營養(yǎng)物質可能已經(jīng)大量消耗而提前到達衰亡期；而到發(fā)酵結束酶已經(jīng)大量失活。當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中液化酶活性達到最高；當培養(yǎng)溫度為32.5 ℃時，糖化酶活性達到最高；當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，酸性蛋白酶活性達到最高。

圖5 培養(yǎng)溫度對紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵產物中消化酶活性的影響Fig.5 Effect of culture temperature on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.3 響應面優(yōu)化試驗結果

紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產糖化酶、液化酶及酸性蛋白酶的最適發(fā)酵周期、最適加水量、最適接種量及最適培養(yǎng)溫度并不相同。由于種子液中水分含量約為90%左右，因此接種量會對加水量造成較大影響，溫度高低不僅影響菌體生長也對微生物體內酶活有較大影響。利用響應面試驗設計，選用加水量、接種量及培養(yǎng)溫度作為自變量，分別以液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶活性作為因變量，對3 種消化酶發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

2.3.1 基于液化酶活性的響應面優(yōu)化 為進一步研究加水量（A）、接種量（B）及培養(yǎng)溫度（C）對液化酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗（表1）。

表1 基于液化酶的響應面試驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface test based on liquefaction enzyme

對結果進行二次回歸擬合，得到液化酶活性的回歸方程為：

液化酶活性（U/g）=119.98-4.70A-9.51B-8.93C+1.88AB-2.28AC-1.23BC-35.85A2-25.52B2-31.33C2

回歸模型P=0.0003（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.4653（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.9629，R2Adj=0.9153，說明該模型能解釋96.29%相應值變化，總變異中有3.71%不能由該模型解釋。可見，該模型與試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖6 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優(yōu)水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵的液化酶活性最高為目的對模型進行優(yōu)化，當加水量為39.67 mL、接種量為19.08%、培養(yǎng)溫度為29.32℃時，液化酶活性可達121.63 U/g。為方便生產控制，設加水量40 mL、接種量20%、培養(yǎng)溫度30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)6 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的液化酶活性為119.27 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖6 加水量、接種量、培養(yǎng)溫度交互影響對液化酶活性的響應面結果Fig.6 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on liquefaction enzyme activity

2.3.2 基于糖化酶活性的響應面優(yōu)化 為進一步研究加水量、接種量及培養(yǎng)溫度對糖化酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗，結果見表2。對結果進行二次回歸擬合，得到糖化酶活性的回歸方程為：

表2 基于糖化酶的響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test based on glucoamylase

糖化酶活性（U/g）=618.66-32.36A-24.07B+1.56C+4.62AB-9.22AC+20.41BC-76.94A2-96.43B2-171.53C2

回歸模型P=0.0001（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.9156（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.9809，R2Adj=0.9564，說明該模型能解釋98.09%相應值變化，總變異中有1.91%不能由該模型解釋。可見該模型與試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖7 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優(yōu)水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵的糖化酶活性最高為目的對模型進行優(yōu)化，當加水量為38.93 mL、接種量為19.35%、培養(yǎng)溫度為30.02℃時，糖化酶活性可達623.693 U/g。為方便生產控制，設加水量38 mL、接種量20%、培養(yǎng)溫度30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)10 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的糖化酶活性為614.32 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖7 加水量、接種量、培養(yǎng)溫度交互影響對糖化酶活性的響應面結果Fig.7 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on glucoamylase activity

2.3.3 基于酸性蛋白酶活性的響應面優(yōu)化 為進一步研究加水量、接種量及培養(yǎng)溫度對酸性蛋白酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗，結果見表3。對結果進行二次回歸擬合，得到糖化酶酶活的回歸方程為：

表3 基于酸性蛋白酶的響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface test based on acid protease

糖化酶活性（U/g）=1212.11-8.08A-10.38B+66.28C-24.60AB-83.00AC+49.32BC-63.05A2-188.38B2-173.49C2

回歸模型P=0.0099（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.8082（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.8967，R2Adj=0.7639，說明該模型能解釋89.67%相應值變化，總變異中有10.33%不能由該模型解釋。可見該模型與試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖8 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優(yōu)水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵的酸性蛋白酶活性最高為目的對模型進行優(yōu)化，當加水量為33.83 mL、接種量為20.10%、培養(yǎng)溫度為31.25 ℃時，酸性蛋白酶活性可達到1 221.21 U/g。為方便生產控制，設加水量35 mL、接種量20%、培養(yǎng)溫度31 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)7 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的酸性蛋白酶活性為1 194.21 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖8 加水量、接種量、培養(yǎng)溫度交互影響對蛋白酶活性的響應面結果Fig.8 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on protease activity

3 討論

從菌株選育和發(fā)酵條件優(yōu)化兩個方面進行研究突破，是獲得高活性酶并走向工業(yè)化生產的必由之路。菌株選育一般采用誘變育種，通過該路徑獲得的有益突變率低，變異的方向和性質難以掌控，但如果選育成功則生產性能有較大突破。影響酶產量的因素很多，各因素之間相互聯(lián)系。響應面分析是一種最優(yōu)化方法，其將體系響應作為一個或多個因素的函數(shù)，運用圖形技術將這種函數(shù)關系顯示出來，從而確定試驗設計中的最優(yōu)化條件。利用響應面分析法優(yōu)化菌株的最適產酶條件，是一種快捷充分發(fā)揮菌株性能的方法。通過對紅曲菌發(fā)酵過程中各種條件進行優(yōu)化，可以促進消化酶產量的增加。國內外學者在這方面做了較多研究，從發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基組成到培養(yǎng)條件均有相關報道。在培養(yǎng)條件的優(yōu)化上，從發(fā)酵時間、初始pH、搖瓶轉數(shù)、裝液量等因素進行研究。戴德慧等［13］在秈米基礎上添加一定比例的豆粕，優(yōu)化后培養(yǎng)的紅曲菌產糖化酶活性達883.7 U/g，蛋白酶活性為462.3 U/g；劉波等［14］用響應面試驗設計對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產生淀粉酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，糖化酶活性為662.2 U/g；薛英麗等［15］篩選出一株產木聚糖酶較高的紫色紅曲菌株，木聚糖酶活性達807.9 U/g。本研究試驗菌株紫色紅曲菌ZH6 經(jīng)響應面優(yōu)化所產生的液化酶、糖化酶及蛋白酶同時具有較高活性，這在飼料工業(yè)中運用具有積極意義。由于本試驗并未研究該菌株產纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等消化酶的特性，因此對其綜合產消化酶能力尚需進一步研究。

紅曲菌及其制劑運用于動物生產有較好效果。高凱等［4］研究表明，0.5%紅曲合生元酵母硒鍺復合制劑可預防斷奶仔豬腹瀉，同時有效促進斷奶仔豬生長發(fā)育，該復合制劑可替代日糧中25 mg/kg 硫酸黏桿菌素和45 mg/kg 金霉素。付興周等［16］發(fā)現(xiàn)，添加紅曲復合添加劑能顯著降低料肉比，顯著提高肉雞的肌肉紅度和黃度，顯著降低滴水損失。紅曲酒糟是一種優(yōu)質蛋白飼料，在蛋雞飼糧中可代替豆粕使用，對蛋雞生產性能無顯著影響，可提高蛋黃色澤，一定程度上改善蛋品質［17］。飼糧中添加一定量（10%～30%）的紅曲酒糟對山羊的生長性能沒有負面影響，并能有效改善脂質代謝［18］。本研究中紫色紅曲菌ZH6 有較高消化酶活性，但在畜禽生產上的運用還需進一步研究。

4 結論

利用紫色紅曲菌ZH6 菌株，以大米為固態(tài)發(fā)酵基質對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產液化酶、糖化酶和酸性蛋白酶的生產工藝進行優(yōu)化，當加水量為42 mL、接種量為20%、培養(yǎng)溫度為33 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)6 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的液化酶活性達119.27 U/g；當加水量為38 mL、接種量為20%、培養(yǎng)溫度為30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)10 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的糖化酶活性為614.32 U/g；當加水量為35 mL、接種量為20%、培養(yǎng)溫度為31 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)7 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態(tài)發(fā)酵生產的酸性蛋白酶活性為1 194.21 U/g。