紅曲菌固態發酵產消化酶生產工藝優化

李紅勝，邢宏博，許贛榮，倪冬姣,2，鄒新華,2，宋漢良，宋 敏，肖小云

（1.佛山播恩生物科技有限公司，廣東 佛山 528100；2.農業農村部生物飼料國家重點實驗室，江西 贛州 341000）

【研究意義】紅曲菌（Monascus）又稱紅曲霉，是一類小型絲狀腐生真菌。在我國，由紅曲菌發酵制得的紅曲在食品著色和藥用方面已有1 000 多年使用歷史［1］。紅曲具有活血化瘀、健脾消食、降血脂、降血壓等功效。紅曲的藥用價值與紅曲菌固態發酵所產生的紅曲色素、莫納可林K（Monacolin K）、麥角固醇、γ-氨基丁酸以及各種酶類、有機酸等次級代謝產物有著密切關系，紅曲菌消化酶就是其中具有應用價值的成分之一。目前，飼料工業用酶制劑主要由芽孢桿菌類、曲霉類等菌株生產，已工業化生產并運用的有植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖化酶等。紅曲菌在生長代謝過程中會產生多種酶類物質，對其合理利用能有效促進動物消化吸收、提高飼料利用率、促進動物生長、預防疾病等［2-5］。【前人研究進展】已有研究表明，大部分紅曲菌都可以產生活性較高的蛋白酶，蛋白酶能將蛋白質水解成氨基酸、多肽等小分子化合物，利用這一特性，紅曲菌在腌漬魚肉、豆腐乳等高蛋白食品的生產加工中運用較為廣泛。我國民間用紅糟（紅曲菌培養物）腌漬后的肉制品顏色鮮艷、肉質鮮嫩且風味獨特［6］。紅曲中的淀粉酶及糖化酶幾乎能將淀粉完全水解成葡萄糖，利用紅曲菌這一特性生產葡萄糖，比采用酸水解法生產葡萄糖具有原料利用率高、成本降低、成品質量高等優點。我國浙江、福建和臺灣等省利用紅曲中的淀粉酶、糖化酶作為糖化發酵劑釀制的紅曲酒遠近馳名。目前紅曲消化酶主要用于肉制品行業和釀造行業，產品有紅曲酒、紅曲醬油、紅曲醋、紅曲腐乳等［7-9］?！颈狙芯壳腥朦c】常規單因素試驗優化發酵條件費時耗力，且未考慮變量間的交互作用。響應面分析采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析尋求最優工藝參數，能夠綜合評價一組變量與響應值（因變量）的關系，可用于優化發酵條件?！緮M解決的關鍵問題】本試驗對紅曲菌產消化酶類的生產工藝進行研究，利用響應面法優化紅曲菌產液化酶、糖化酶、蛋白酶的發酵條件，為紅曲菌在飼料工業的運用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試7 株紅曲菌為實驗室保存菌株，包括紅色紅曲菌9901、叢毛紅曲菌9908、紅色紅曲菌9909、紫色紅曲菌W1、紫色紅曲菌ZH2、紫色紅曲菌ZH6 和紫色紅曲菌SJS-6。

PDA 瓊脂斜面培養基：去皮土豆200 g，切塊，加水800 mL 煮沸30 min，經8 層紗布過濾，用雙蒸水定容至1 000 mL，向濾液中加入20 g 葡萄糖、20 g 瓊脂，融化后倒入試管。115℃滅菌15 min，滅菌后放置斜面。

種子培養基：葡萄糖 60 g/L，蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，玉米漿粉6 g/L。121℃滅菌20 min。

發酵培養基：廣西秈米50 g，加適量雙蒸水滅菌冷卻。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種斜面制備 將在4 ℃冰箱保藏的菌種置于30 ℃恒溫箱中活化24 h，在超凈工作臺中將菌種轉接至新鮮PDA 斜面上，然后放入30℃恒溫箱中培養8 d。

1.2.2 孢子懸浮液制備 在超凈工作臺中用無菌水將菌種孢子從斜面洗脫下來，制成孢子濃度為1×106個/mL 的孢子懸液，用于接種。

1.2.3 液態種子培養 取上述孢子懸液按一定比例接種至裝有100 mL 種子培養基的三角瓶中，在30 ℃、170 r/min 的旋轉式搖床中培養48 h。

1.2.4 固態發酵培養 將培養好的液態種子按一定比例（最佳為25%）接種至裝有50 g 發酵培養基的三角瓶中，于生化培養箱30 ℃培養7 d。

1.2.5 單因素試驗 分別對發酵時間（2、4、6、8、10 d）、加水量（30、35、40、45、50 mL）、接種量（15%、20%、25%、30%、35%）、發酵溫度（25、27.5、30、32.5、35 ℃）進行紅曲菌發酵產消化酶試驗，以發酵產物中糖化酶、液化酶及蛋白酶的活性為指標，確定各因素的最佳發酵條件。

1.2.6 響應面優化試驗 利用統計分析軟件Minitab15 版進行試驗設計和數據分析。在單因素試驗基礎上，分別以加水量、接種量、發酵溫度為自變量，以紅曲菌ZH6 固態發酵產物中糖化酶、液化酶、蛋白酶的活性為因變量進行響應面優化。

1.3 消化酶活性檢測

1.3.1 液化酶 取1.000 g 烘干后粉碎的紅曲米加水18 mL、pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液2 mL，于40 ℃恒溫水浴1 h，期間20 min 震蕩1 次，用慢性濾紙過濾備用。液化酶活力的測定采用分光光度法［10］。1 mL 酶液在40 ℃下1 h 水解1 mg淀粉為1 個活力單位。

1.3.2 糖化酶 取1.000 g 烘干后粉碎的紅曲米加水18 mL、pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液2 mL，于40 ℃恒溫水浴1 h，期間20 min 震蕩1 次，用慢性濾紙過濾備用。糖化酶活力的測定采用DSN法［11］。1 mL 酶液在40 ℃下水解可溶性淀粉生成1 mg 葡萄糖為1 個活力單位。

1.3.3 蛋白酶 參照國家標準GB/T 23527-2009蛋白酶制劑，采用福林-酚試劑法［12］測定蛋白酶活性。1 mL 酶液在40 ℃下水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸為1 個活力單位。

2 結果與分析

2.1 7 株紅曲菌固態發酵產物中消化酶活性比較

從圖1 可以看出，不同菌株的代謝產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性存在較大差異，這可能與不同菌株代謝途徑存在一定差異有關。7 株紅曲菌中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性最高的菌株均為紫色紅曲菌ZH6。蛋白酶又分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶。從圖1 可知，7株紅曲菌所產生的蛋白酶均在酸性條件下活性最高。這可能與紅曲菌嗜酸特性有一定關系，在堿性條件下蛋白酶受到一定損傷，因此紅曲菌產生的蛋白酶活性在酸性條件下最高［13］。因此后續試驗選取紫色紅曲菌ZH6 分別對紅曲發酵產物中液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶活性作進一步研究。

圖1 不同紅曲菌固態發酵產物中消化酶活性比較Fig.1 Comparison of digestive enzyme activities in solidstate fermentation product of different Monascus strains

2.2 紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產消化酶單因素試驗結果

2.2.1 發酵時間對發酵產物中消化酶活性的影響固定加水量為40 mL、培養溫度為30 ℃、接種量為20%，研究發酵時間對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖2 可以看出，發酵時間對紫色紅曲菌ZH6 發酵產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性均有較大影響。隨著發酵時間的增加，代謝產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性先增高后降低，這可能是由于在發酵前期菌體大量繁殖同時需要較多營養物質，底物消耗較快，因此隨著菌體生長繁殖產生大量消化酶，但發酵后期由于底物大量消耗已不能滿足菌體生長需要而進入衰亡期，導致酶活降低且底物消耗速率減緩。紫色紅曲菌ZH6 液化酶的最適發酵周期為6 d，而糖化酶的最適發酵周期為10 d，這可能是由于淀粉在酶解過程中分為糖化和液化兩個過程，在淀粉酶解過程中液化酶通過酶解將淀粉分解為糊精及低聚糖，而后由糖化酶將其水解為葡萄糖。酸性蛋白酶在發酵8 d 時酶活達到最高。

圖2 發酵時間對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中消化酶活性的影響Fig.2 Effects of fermentation time on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.2 加水量對發酵產物中消化酶活性的影響選用水分含量為8.8%的大米作為固態發酵基質，固定接種量為20%、培養溫度為30℃、發酵時間為7 d，分別加水30、35、40、45、50 mL，研究加水量對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖3 可以看出，固態發酵基質的加水量對紅曲菌固態發酵產物中液化酶、糖化酶及蛋白酶活性具有一定影響。當紅曲菌固態發酵基質中加水40 mL（即初始水分含量為49.33%）時，液化酶活性達到最高；當加水45 mL（即初始水分含量為52%）時，糖化酶活性達到最高；當加水35 mL（即初始水分含量為46.35%）時，酸性蛋白酶活性達到最高。因此，同一菌株對不同代謝產物的最適水分含量也不同。

圖3 加水量對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中消化酶活性的影響Fig.3 Effect of water addition on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.3 接種量對發酵產物中消化酶活性的影響固定加水量為40 mL、培養溫度為30 ℃、發酵時間為7 d，分別接種15%、20%、25%、30%、35%研究接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖4可以看出，接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶、糖化酶、酸性蛋白酶的活性均有一定影響，隨著接種量的增加，各酶活性先增加后降低，當接種量為20%時，液化酶及酸性蛋白酶活性達到最高；當接種量為25%時，糖化酶活性達到最高。

圖4 接種量對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中消化酶活性的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.2.4 培養溫度對發酵產物中消化酶活性的影響紅曲菌生長適宜的溫度范圍較廣，可在15～42 ℃生長。固定加水量為40 mL、接種量為20%、發酵時間為7 d，分別在25、27.5、30、32.5、35 ℃培養，研究培養溫度對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶、糖化酶、蛋白酶活性的影響。從圖5 可以看出，發酵溫度對紅曲菌固態發酵產物中液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶的活性均有一定影響。25～30 ℃時，隨著溫度升高酶活性升高；30～35 ℃時，隨著溫度繼續升高酶活性反而降低。這可能是由于隨著溫度升高酶活性相對較高，菌體生長較快，從而產生大量酶；但超出一定溫度范圍后，生長過快的菌體在發酵后期營養物質可能已經大量消耗而提前到達衰亡期；而到發酵結束酶已經大量失活。當培養溫度為30 ℃時，紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中液化酶活性達到最高；當培養溫度為32.5 ℃時，糖化酶活性達到最高；當培養溫度為30 ℃時，酸性蛋白酶活性達到最高。

圖5 培養溫度對紫色紅曲菌ZH6 固態發酵產物中消化酶活性的影響Fig.5 Effect of culture temperature on digestive enzyme activity in solid-state fermentation product of Monascus purpureus ZH6

2.3 響應面優化試驗結果

紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產糖化酶、液化酶及酸性蛋白酶的最適發酵周期、最適加水量、最適接種量及最適培養溫度并不相同。由于種子液中水分含量約為90%左右，因此接種量會對加水量造成較大影響，溫度高低不僅影響菌體生長也對微生物體內酶活有較大影響。利用響應面試驗設計，選用加水量、接種量及培養溫度作為自變量，分別以液化酶、糖化酶及酸性蛋白酶活性作為因變量，對3 種消化酶發酵工藝進行優化。

2.3.1 基于液化酶活性的響應面優化 為進一步研究加水量（A）、接種量（B）及培養溫度（C）對液化酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗（表1）。

表1 基于液化酶的響應面試驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface test based on liquefaction enzyme

對結果進行二次回歸擬合，得到液化酶活性的回歸方程為：

液化酶活性（U/g）=119.98-4.70A-9.51B-8.93C+1.88AB-2.28AC-1.23BC-35.85A2-25.52B2-31.33C2

回歸模型P=0.0003（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.4653（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.9629，R2Adj=0.9153，說明該模型能解釋96.29%相應值變化，總變異中有3.71%不能由該模型解釋?？梢姡撃Ｐ团c試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖6 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態發酵的液化酶活性最高為目的對模型進行優化，當加水量為39.67 mL、接種量為19.08%、培養溫度為29.32℃時，液化酶活性可達121.63 U/g。為方便生產控制，設加水量40 mL、接種量20%、培養溫度30 ℃、發酵培養6 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的液化酶活性為119.27 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖6 加水量、接種量、培養溫度交互影響對液化酶活性的響應面結果Fig.6 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on liquefaction enzyme activity

2.3.2 基于糖化酶活性的響應面優化 為進一步研究加水量、接種量及培養溫度對糖化酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗，結果見表2。對結果進行二次回歸擬合，得到糖化酶活性的回歸方程為：

表2 基于糖化酶的響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test based on glucoamylase

糖化酶活性（U/g）=618.66-32.36A-24.07B+1.56C+4.62AB-9.22AC+20.41BC-76.94A2-96.43B2-171.53C2

回歸模型P=0.0001（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.9156（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.9809，R2Adj=0.9564，說明該模型能解釋98.09%相應值變化，總變異中有1.91%不能由該模型解釋?？梢娫撃Ｐ团c試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖7 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態發酵的糖化酶活性最高為目的對模型進行優化，當加水量為38.93 mL、接種量為19.35%、培養溫度為30.02℃時，糖化酶活性可達623.693 U/g。為方便生產控制，設加水量38 mL、接種量20%、培養溫度30 ℃、發酵培養10 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的糖化酶活性為614.32 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖7 加水量、接種量、培養溫度交互影響對糖化酶活性的響應面結果Fig.7 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on glucoamylase activity

2.3.3 基于酸性蛋白酶活性的響應面優化 為進一步研究加水量、接種量及培養溫度對酸性蛋白酶活性的交互影響，在前期單因素試驗基礎上設計3 因素3 水平試驗，結果見表3。對結果進行二次回歸擬合，得到糖化酶酶活的回歸方程為：

表3 基于酸性蛋白酶的響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface test based on acid protease

糖化酶活性（U/g）=1212.11-8.08A-10.38B+66.28C-24.60AB-83.00AC+49.32BC-63.05A2-188.38B2-173.49C2

回歸模型P=0.0099（＜0.01），說明該模型極顯著；失擬項P=0.8082（＞0.05），說明該模型沒有失擬，因此該模型可信度較高。因變量與自變量之間的線性關系顯著，R2=0.8967，R2Adj=0.7639，說明該模型能解釋89.67%相應值變化，總變異中有10.33%不能由該模型解釋?？梢娫撃Ｐ团c試驗擬合良好，該回歸方程能用于描述各因素與響應值之間的關系。

從圖8 可以看出，曲面最高點均在響應面上，故各因素最優水平在所選范圍內；用Design-Expert 8.0.1 以紫色紅曲菌ZH6 固態發酵的酸性蛋白酶活性最高為目的對模型進行優化，當加水量為33.83 mL、接種量為20.10%、培養溫度為31.25 ℃時，酸性蛋白酶活性可達到1 221.21 U/g。為方便生產控制，設加水量35 mL、接種量20%、培養溫度31 ℃、發酵培養7 d，在此條件下紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的酸性蛋白酶活性為1 194.21 U/g，與預測結果差異較小，說明該模型預測值與試驗值具有良好的擬合性。

圖8 加水量、接種量、培養溫度交互影響對蛋白酶活性的響應面結果Fig.8 Response surface results of the interaction of water addition,inoculation amount and temperature on protease activity

3 討論

從菌株選育和發酵條件優化兩個方面進行研究突破，是獲得高活性酶并走向工業化生產的必由之路。菌株選育一般采用誘變育種，通過該路徑獲得的有益突變率低，變異的方向和性質難以掌控，但如果選育成功則生產性能有較大突破。影響酶產量的因素很多，各因素之間相互聯系。響應面分析是一種最優化方法，其將體系響應作為一個或多個因素的函數，運用圖形技術將這種函數關系顯示出來，從而確定試驗設計中的最優化條件。利用響應面分析法優化菌株的最適產酶條件，是一種快捷充分發揮菌株性能的方法。通過對紅曲菌發酵過程中各種條件進行優化，可以促進消化酶產量的增加。國內外學者在這方面做了較多研究，從發酵過程中的培養基組成到培養條件均有相關報道。在培養條件的優化上，從發酵時間、初始pH、搖瓶轉數、裝液量等因素進行研究。戴德慧等［13］在秈米基礎上添加一定比例的豆粕，優化后培養的紅曲菌產糖化酶活性達883.7 U/g，蛋白酶活性為462.3 U/g；劉波等［14］用響應面試驗設計對紅曲菌固態發酵產生淀粉酶的培養基進行優化，糖化酶活性為662.2 U/g；薛英麗等［15］篩選出一株產木聚糖酶較高的紫色紅曲菌株，木聚糖酶活性達807.9 U/g。本研究試驗菌株紫色紅曲菌ZH6 經響應面優化所產生的液化酶、糖化酶及蛋白酶同時具有較高活性，這在飼料工業中運用具有積極意義。由于本試驗并未研究該菌株產纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等消化酶的特性，因此對其綜合產消化酶能力尚需進一步研究。

紅曲菌及其制劑運用于動物生產有較好效果。高凱等［4］研究表明，0.5%紅曲合生元酵母硒鍺復合制劑可預防斷奶仔豬腹瀉，同時有效促進斷奶仔豬生長發育，該復合制劑可替代日糧中25 mg/kg 硫酸黏桿菌素和45 mg/kg 金霉素。付興周等［16］發現，添加紅曲復合添加劑能顯著降低料肉比，顯著提高肉雞的肌肉紅度和黃度，顯著降低滴水損失。紅曲酒糟是一種優質蛋白飼料，在蛋雞飼糧中可代替豆粕使用，對蛋雞生產性能無顯著影響，可提高蛋黃色澤，一定程度上改善蛋品質［17］。飼糧中添加一定量（10%～30%）的紅曲酒糟對山羊的生長性能沒有負面影響，并能有效改善脂質代謝［18］。本研究中紫色紅曲菌ZH6 有較高消化酶活性，但在畜禽生產上的運用還需進一步研究。

4 結論

利用紫色紅曲菌ZH6 菌株，以大米為固態發酵基質對紅曲菌固態發酵產液化酶、糖化酶和酸性蛋白酶的生產工藝進行優化，當加水量為42 mL、接種量為20%、培養溫度為33 ℃、發酵培養6 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的液化酶活性達119.27 U/g；當加水量為38 mL、接種量為20%、培養溫度為30 ℃、發酵培養10 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的糖化酶活性為614.32 U/g；當加水量為35 mL、接種量為20%、培養溫度為31 ℃、發酵培養7 d 時，紫色紅曲菌ZH6 固態發酵生產的酸性蛋白酶活性為1 194.21 U/g。