Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中的表達及臨床意義

[摘要]目的：探討Tyrosinase、Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中表達及意義。方法：收集2012年1月-2019年10月52例非典型黑素痣組織及20例正常皮膚組織。采用EnVision二步法檢測Tyrosinase、Nestin、CD34的表達。結果：Tyrosinase和Nestin在交界痣中陽性率為100.0%和0.0%，復合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織陽性率分別為100.0%，68.4%，0.0%;0.0%，10.5%，89.5%，皮內痣中真皮淺層及真皮深層組織陽性率分別為88.2%，0.0%;29.4%，88.2%，正常皮膚組織陽性率為100.0%，15.0%。非典型黑素痣細胞不表達CD34，正常皮膚組織血管內皮細胞中CD34呈強陽性。復合痣和皮內痣表皮組織痣細胞Tyrosinase陽性率顯著高于真皮深層組織（P=0.0300，0.0001）;復合痣和皮內痣真皮淺層痣細胞Nestin陽性率顯著低于真皮深層組織（P=0.0001，0.0020）。復合痣和皮內痣的真皮淺層痣細胞中Tyrosinase和Nestin高表達率比較，差異有統計學意義（P=0.0010，0.0020）;復合痣和皮內痣的真皮深層痣細胞中Nestin與Tyrosinase高表達率比較，差異有統計學意義（P=0.0000，0.0001）。結論：非典型黑素痣從表皮、真皮淺層到真皮深層Tyrosinase陽性率逐漸降低，Nestin陽性率逐漸增加，不表達CD34，Tyrosinase/Nestin的表達趨勢可解釋黑素細胞前體分化、遷移過程。

[關鍵詞]非典型黑素痣;酪氨酸酶;巢蛋白;CD34;干細胞

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）10-0014-04

Expression and Clinical Significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in Dysplastic Melanocytic Nevi

CHEN Zhao-hui

（Department of Dermatology，the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830064，Xinjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the expression and significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in dysplastic melanocytic nevi. Methods? 52 cases of dysplastic melanocytic nevi and 20 cases of normal skin tissue from January 2012 to October 2019 were collected. The expression of Tyrosinase， Nestin and CD34 were detected by EnVision two-step method. Results? The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%， 0.0% in junctional nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 100.0%， 0.0% in epidermis， 68.4%， 10.5% in superficial dermis and 0.0%， 89.5% in deep dermis of compound nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 88.2%， 29.4% in superficial dermis and 0.0%， 88.2% in deep dermis of intradermal nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%，15.0% in normal skin tissue. All junctional， compound， and intradermal nevi were negative for CD34 within nevus cells， while normal skin tissues were strongly positive for CD34 in vascular endothelial cells. The positive rate of Tyrosinase in epidermal tissue of compound and intradermal nevi was significantly higher than that in deep dermis （P=0.0300， 0.0001）. The positive rate of Nestin in superficial dermal nevocytes of compound， intradermal nevi was significantly lower than that in deep dermal nevocytes （P=0.0001， 0.0020）. The high expression rates of tyrosinase and nestin in superficial dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus were statistically significant （P=0.0010， 0.0020）. There was significant difference in the high expression rate of nestin and tyrosinase in deep dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus （P=0.0000， 0.0001）. Conclusion? The positive rate of tyrosinase and Nestin in dysplastic melanocytic nevi decreased gradually from epidermis， superficial dermis to deep dermis， while the positive rate of Nestin increased gradually. The expression trend of tyrosinase/Nestin can explain the process of melanocyte precursor differentiation and migration.

Key words： dysplastic melanocytic nevi; Tyrosinase; Nestin; CD34; stem cells

非典型黑素痣（Dysplastic melanocytic nevi）是惡性黑素細胞瘤的惡性前病變，分為皮內痣、交界痣及混合痣。惡性黑素細胞瘤與良性痣需要使用免疫組織化學鑒別[1]。雖然一些黑素細胞譜系標記物可用于區別良惡性[2-3]，但這些標記物靈敏度、特異度差，因此尋找到一種更具價值的標記物迫在眉睫。酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑素細胞成熟過程中的主要黑色素生成酶，也是黑素細胞分化程度的特異性標記物。研究發現，表皮或淺表真皮痣細胞高表達酪氨酸酶，而深層皮膚小痣細胞低表達酪氨酸酶[4]。近年來發現，腫瘤干細胞在黑素瘤發生發展中起到重要的作用[5]。Nestin、CD34作為腫瘤干細胞標記物，在神經脊干細胞及神經細胞高表達[6]。但是黑素細胞痣如何轉變為黑素細胞瘤的研究知之甚少。因此，本研究檢測了獲得性非典型黑素痣及正常皮膚組織中Tyrosinase、Nestin及CD34的表達，以期為黑素細胞瘤的早期診斷尋找到一種標記物。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：收集2012年1月-2019年10月在筆者醫院明確診斷為非典型黑素痣的52例患者的病理及臨床資料。所有標本均取自手術或活檢。其中交界痣16例，復合痣19例和皮內痣17例;部位：背部40例，下肢3例，上肢3例，頭頸部6例;男30例，女22例;年齡15～73歲，平均（40.5±9.3）歲。選取同期正常人群20例為對照組，男11例，女9例;年齡15～67歲，平均（39.2±8.4）歲。正常皮膚標本取自眼瞼、外耳道和胸部。陽性對照乳腺癌標本來自筆者醫院病理科保存標本。本研究得到了入選對象的知情同意，并征得醫院倫理道德委員會的批準。

1.2 免疫組化檢測Tyrosinase、Nestin及CD34蛋白表達：制備4μm厚連續切片，脫蠟并修復抗原，采用EnVision二步法檢測Tyrosinase、Nestin、CD34的表達，嚴格按照試劑盒說明書進行，加入兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆一抗（1：100，1：100，1：50），4℃冰箱過夜，PBS洗滌后加入二抗，PBS洗滌，DAB顯色，水洗，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，封片。陽性對照采取乳腺癌切片， 陰性對照用正常血清代替抗體。免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆抗體購自美國Sigma公司，鼠抗兔單克隆二抗購自美國Sigma公司。Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白定位于細胞漿，均以胞質呈紅色為陽性染色細胞。高倍鏡下選取5個隨機視野，觀察1 000個細胞，按照陽性細胞比例分為：<10%（0分）;10%～49%（1分）;50%～89%（2分）;≥90%（3分）。按照陽性細胞染色強度分為：陰性（0分）;弱陽性（1分）;中等陽性（2分）;強陽性（3分）。計算陽性細胞比例×陽性細胞染色強度，規定0～6分為低表達，7～12分為高表達。所有切片均由病理科副主任醫師以上職稱的同一醫生雙盲閱片，重復三次，取平均值。

1.3 統計學分析：使用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計數資料采用（n，%）表示，χ2檢驗進行組間比較。采用四格表對Tyrosinase和Nestin表達的相關性進行分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白表達情況：Tyrosinase蛋白在黑素細胞痣組織中呈巢狀或團狀分布。16例交界痣中Tyrosinase陽性率為100.0%，陽性細胞位于表皮真皮交界處，呈團狀分布（見圖1）;19例復合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織Tyrosinase陽性率分別為100.0%，68.4%，0.0%，染色強度逐漸減弱（見圖2）;17例皮內痣中真皮淺層及真皮深層組織Tyrosinase陽性率分別為88.2%，0.0%，染色強度逐漸減弱（見圖3）。20例正常皮膚組織中Tyrosinase陽性率為100.0%，陽性細胞位于表皮基底層，呈巢狀分布（見圖4）。

16例交界痣中Nestin陽性率為0.0%（見圖1）;19例復合痣中表皮、真皮淺層及真皮深層組織Nestin陽性率分別為0.0%，10.5%，89.5%，染色強度逐漸增強（見圖2）;17例皮內痣中真皮淺層及真皮深層組織Nestin陽性率分別為29.4%，88.2%，染色強度逐漸增強（見圖3）。正常皮膚組織及獲得性非典型黑素痣血管周圍可見Nestin強陽性（見圖4B，5A）。獲得性非典型黑素痣毛囊的隆突部位Nestin強陽性（見圖5A）。

獲得性非典型性黑素細胞不表達CD34，而在血管內皮細胞、痣巢周圍結締組織的基質細胞及毛囊的隆突部位可觀察到CD34的強陽性表達（見圖5B，6）。正常皮膚組織血管內皮細胞中CD34呈強陽性（見圖4C）。

復合痣和皮內痣表皮組織Tyrosinase陽性率顯著高于真皮深層組織，差異有統計學意義（P=0.0300，0.0001）。復合痣和皮內痣真皮淺層Nestin陽性率顯著低于真皮深層組織，差異有統計學意義（P=0.0001，0.0020）。見表1。

3? 討論

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是一種含雙核金屬銅的氧化還原酶，是黑色素合成過程的限速酶。研究顯示，酪氨酸酶在黑素瘤組織中呈陽性表達，且表達強度隨黑素瘤的惡性程度的提高而增加[7]。另外研究表明，黑素瘤患者外周血Tyrosinase水平高于正常人群，與患者的生存率呈負相關[8]。本研究采用免疫組織化學方法檢測了交界痣、復合痣和皮內痣組織Tyrosinase的表達，結果顯示，Tyrosinase在交界痣組織中陽性率最高，復合痣次之，皮內痣最低。現已證實，部分黑素瘤是由黑素細胞痣惡變而來，交界痣比皮內痣易惡變，本研究結果提示Tyrosinase可能與痣細胞惡變過程有關，通過檢測Tyrosinase可早期預測痣細胞的惡變。

惡性黑素瘤是起源于神經嵴的黑素細胞的高度惡性腫瘤，研究發現，黑素瘤中存在一定數量的腫瘤干細胞，在黑素瘤發育前期，腫瘤干細胞周期進行的非常緩慢，稱為惡變前腫瘤干細胞[9]。這群細胞受到紫外線照射、損傷等作用后可發生突變，形成惡性黑素瘤干細胞。Nestin作為神經來源干細胞的標記物，在多種腫瘤干細胞高表達，Akiyama等發現，CD133和Nestin在惡性黑素瘤組織中陽性表達率均高于黑素細胞痣[10]。Tyrosinase是黑素細胞成熟的標記物，而Nestin則提示黑素細胞不成熟的標記物，本研究結果顯示，表皮和真皮淺表痣細胞中Tyrosinase高表達，Nestin低表達，而真皮深層痣細胞Tyrosinase低表達，Nestin高表達，存在一定的相關性，提示Tyrosinase和Nestin可作為從多能性黑素細胞前體到成熟黑素細胞的標記物，據此筆者推測黑素細胞痣中Tyrosinase/Nestin的分布可以作為一種“病理組織學模式”來監測痣細胞在病理性增殖的情況下的分化狀態。

正常皮膚組織中，雖然大多數細胞是分化成熟的黑素細胞，但仍有多能干細胞存在于真皮、毛囊的隆起區域和表皮中。最近研究發現，毛囊的突起區域存在一群神經嵴來源的干細胞，在體外可分化為黑素細胞[11]。本研究結果顯示，毛囊突起區域的小細胞聚集物高表達干細胞標記物Nestin和CD34，提示這群細胞可能是神經嵴來源的黑素細胞干細胞的貯存庫。推測黑素細胞干細胞沿著周圍神經或血管，在真皮和毛囊的突起區域聚集。這群細胞被激活后，如果不發生突變，則向表皮遷移，分化為正常黑素細胞;如果發生突變，他們會異常增殖和遷移，從而形成痣細胞，甚至惡變。

綜上所述，Tyrosinase、Nestin在交界痣、復合痣和皮內痣不同部位表達有差異，Tyrosinase聯合Nestin檢測可用于黑素細胞瘤疑難病例的診斷。同時分析Tyrosinase、Nestin在黑素細胞痣中的分布可以提供一個“組織病理學模式”，有助于追蹤神經嵴衍生的黑素細胞前體向其最終解剖和功能部位進入的分化途徑。

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[收稿日期]2020-08-17

本文引用格式：陳趙慧.Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣組織中的表達及臨床意義[J].中國美容醫學，2021，30（10）：14-17.