凱氏定氮法測大豆粉中蛋白質含量的不確定度評定

◎ 馬曉倩，方 玲，袁月蘭，趙成明

（馬鞍山市產品質量監督檢驗所，安徽 馬鞍山 243000）

目前蛋白質的檢測方法主要有凱氏定氮法[1]、分光光度法和燃燒法，第一法和第二法適用于各種食品中蛋白質的測量，第三法適用于蛋白質含量在10 g/100 g以上的糧食、豆類奶粉、米粉、蛋白質粉等固體試樣的測量。其中第一法凱氏定氮法測食品中的蛋白質是仲裁法，檢測方法更加簡單，檢測結果更加準確可靠。針對不同食品，蛋白質含量有不同要求，當檢測結果在限量值附近時，結果的準確性具有重要影響，不確定度[2]是檢測檢驗結果的準確性的重要指標。本文采用《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）[3]中的第一法凱氏定氮法測量大豆粉中的蛋白質，根據蛋白質的計算方法建立數學模型。以《測量不確定度評定與表示》[4]（JJF 1059.1—2012）系統性地分析不確定來源，為樣品檢測結果提供可靠地科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉，市鹽；酸標準滴定溶液，0.100 0 mol·L-1；氫氧化鈉溶液，400 g·L-1；甲基紅乙醇溶液，1 g·L-1；亞甲基藍乙醇溶液，1 g·L-1；硼酸溶液，20 g·L-1；水為三級用水。

1.2 儀器與設備

Kjeltec 8400 凱氏定氮儀（瑞典，Foss）；Kjeltec 8400 八管消化爐（瑞典，Foss）；ME204E/02 梅特勒-托利多電子天平（分度值0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）。

1.3 測量方法

稱取充分混勻的固體試樣0.5 g于消化管中，精確至0.001 g，再加入10 mL的硫酸溶液、0.4 g硫酸銅和6 g硫酸鉀于消化爐中進行消化。當消化爐溫度達到420 ℃之后，繼續消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻至室溫。設置儀器參數稀釋液體積為70 mL，堿液體積為50 mL，接收液體積為30 mL，于全自動凱氏定氮儀[5]上實現全自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據過程，實驗前需做2次空白實驗，再依次測量5次樣品。

2 數學模型

根據蛋白質的計算原理，得出蛋白質含量計算公式如下：

式中：X-試樣中蛋白質的含量，g/100 g；V-試液消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V0-試劑空白消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；C-鹽酸標準滴定溶液濃度，mol·L-1；0.014 0-1.0 mL鹽酸標準滴定溶液相當的氮的質量，g；M-試樣的質量，g；5.71-大豆粉中氮換算為蛋白質的系數；100-換算系數。

3 結果與分析

3.1 不確定度來源分析

凱氏定氮法測定大豆粉中蛋白質的含量的不確定度的來源主要是鹽酸標準溶液的配制標定過程、氯化銨標準物質、分析儀器的重復測量過程以及樣品前處理稱量過程等環節。

3.2 鹽酸標準溶液不確定度分量urel1

3.2.1 鹽酸標準溶液的配制和標定

根據GB/T 601—2016[6]標準要求，先用濃鹽酸配制成1 000 mL的0.1 mol·L-1的鹽酸標準滴定溶液。重復滴定6次，計算得出鹽酸標準溶液濃度分別為0.101 34 mol·L-1、0.101 51 mol·L-1、0.101 21 mol·L-1、0.101 32 mol·L-1、0.101 48 mol·L-1和 0.101 37 mol·L-1。鹽酸標準溶液的平均濃度為0.101 4 mol·L-1。鹽酸標準溶液滴定結果引入的標準偏差和相對標準不確定度分別為：

3.2.2 標定鹽酸的基準試劑碳酸鈉的純度

按照GB/T 601—2016標準要求，將基準試劑無水碳酸鈉于270～300 ℃的高溫爐中烘干至恒重。基準試劑碳酸鈉的純度為100%±0.05%，視為矩形分布為：

3.2.3 天平稱量所引入的標準不確定度

干燥器與天平[7]稱量內均放置相同硅膠，稱量時無吸潮。本次稱量使用的天平是ME204E/02梅特勒-托利多電子天平，天平的量程為0～220 g，分度值為s=0.1 mg，根據該天平檢定證書可知，在0～50 g稱量范圍內，天平的最大允許誤差為0.000 5 g，采用矩形分布計算稱樣量為0.2 g時的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

3.2.4 標定體積的不確定度

根據鹽酸標準滴定溶液滴定的體積平均為37.25 mL，滴定使用50 mL酸式滴定管（A級），根據常用玻璃檢定規程可知，50 mL的A級酸式滴定管的最大允許差為±0.05 mL，滴定體積平均為37.25 mL，按照矩形分布計算出標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

3.2.5 測量重復性帶來的不確定度分量

測量重復性帶來的不確定度分量ur5為0.001（主要包括人員、環境、測量方法和儀器重復性等其他分量帶來的不確定度），則標準滴定溶液所引入的不確定度為：

3.3 氯化銨標準物質引入的不確定度分量urel2

本次校準實驗使用的氯化銨標準物質編號為GBW06103，由國防科技工業應用化學一級計量站提供。根據標準證書得出其相對擴展不確定度urel=0.08%，k=2，則標準物質引入的不確定度分量為：

3.4 分析儀器的不確定度分量urel3

在同一條件下，使用凱氏定氮儀對消解的5組平行樣品進行測定，結果如表1所示。

表1 大豆粉中蛋白質的測量結果表

根據試樣分析結果，可計算出蛋白質的標準差s為：

其標準不確定度和相對標準不確定度分別為：

3.5 樣品稱量的標準不確定度分量urel4

根據該天平檢定證書可知，在0～50 g稱量范圍內，天平的最大允許誤差為0.000 5 g，采用矩形分布計算稱樣量為0.471 4 g時的標準不確定度為：

3.6 合成標準擴展不確定度評定

實驗分析得到的不確定度分量之間互不相關，則使用凱氏定氮法測定大豆粉中的蛋白質的合成標準擴展不確定度為：

3.7 擴展不確定度評定及結果分析

假設測量過程中的誤差屬于正態分布，取包含因子k=2（置信區間為95%），則大豆粉中蛋白質的含量擴展不確定度為：U=k×uc=0.10×2=0.20。全自動凱氏定氮儀法測量大豆粉中蛋白質含量結果表示為X=（32.69±0.20）g/100 g，k=2（置信區間為95%）。

4 結語

本研究通過建立數學模型計算出蛋白質的含量，并從標準溶液、氯化銨標準物質、實驗分析儀器以及樣品稱量等不確定因素分析大豆粉中蛋白質的不確定度，其中標準溶液和實驗分析儀器是不確定度的主要影響因素。因此在實驗過程中，應確保標準溶液配制的準確性和實驗分析儀器的穩定性。當使用儀器時，應提前配制好實驗試劑，在做大批量實驗前，應對實驗儀器回收率進行測量校準，確保實驗儀器的回收率和穩定性滿足實驗要求，降低不確定度，提高實驗檢測結果的準確性。