氣相色譜法測定酒類中乙醇含量方法優化

◎ 馮雪紅，蔡偉源，羅培余，鄒清輝，周建平

（1.天地壹號飲料股份有限公司，廣東 江門 529000；2.廣東天地壹號食品研究院有限公司，廣東 江門 529000；3.廣東省壹柑園食品有限公司，廣東 江門 529000）

檢測乙醇含量有多種方法，其中氣相色譜法又分為外標法和內標法[1-3]，內標法較外標法更為精準。由于《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225—2016）[4]方法中，其主要使用玻璃填充柱，存在色譜理論塔板數較低、分離度差、易干擾等缺點，且內標法中使用的正丁醇或4-甲基-2-戊醇在水中的溶解度均不高，在實際操作過程所需較長時間才能完全溶解，效率較低，易造成內標峰面積差異大，影響測定結果。

為克服《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225—2016）方法中存在的不足，本文在現有標準的測定方法的基礎上，參考《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》（GB 5009.266—2016）[5]，通過優化色譜條件和內標物選擇，以提高檢測回收率和檢測效率。本方法可對果酒、葡萄酒和酒進行乙醇含量的測定，并以蘋果酒為例對優化后的方法進行討論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

蘋果酒，天地壹號飲料股份有限公司發酵車間生產；葡萄酒，長城干紅，中國長城葡萄酒有限公司；啤酒，雪花純生，華潤雪花啤酒（中國）有限公司。

1.1.2 試劑

無水乙醇：色譜純，CNW Technologies GmbH；叔戊醇：色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；4-甲基-2-戊醇，分析純，純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 儀器

GC-2014C氣相色譜儀（島津公司）；全玻璃蒸餾裝置（北京玻璃集團泰州博美玻璃儀器廠）；HQ-60-IV渦旋振蕩器（北京北方同正生物技術發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 乙醇標準系列工作液的配制

配制乙醇標準系列工作液：取5個100 mL容量瓶，分別吸入2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和7.00 mL乙醇，用水定容至刻度，混勻。分別將不同濃度的乙醇標準系列工作液10 mL置于25 mL容量瓶中，分別加入0.2 mL叔戊醇，渦旋振蕩1 min，得到乙醇標準系列工作液。

1.2.2 樣品前處理

吸取蘋果酒100 mL試樣于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL水和幾顆沸石，連接冷凝管，用100 mL容量瓶作為接收器，外加冰浴，并開啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液；當接近刻度時，取下容量瓶，待溶液冷卻至室溫后，用水定容至刻度，混勻。吸取10.0 mL蒸餾后的溶液于試管中，加入0.10 mL內標物叔戊醇標準溶液，混勻，備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱選用聚乙二醇-20M為固定相的石英毛細柱。柱長30 m×孔徑0.25 mm×膜厚度0.25 μm。柱溫及升溫程序具體為：50 ℃，保持2 min；5℃·min-1升溫至 90 ℃；25 ℃·min-1升溫至190 ℃，保持3 min。進樣口和檢測器溫度：250 ℃；載氣（高純氮）流量：1.0 mL·min-1；控制方式：線速度；吹掃流量：3.0 mL·min-1；進樣量：1.0 μL；分流比：1 ∶ 99；尾吹流量：30 mL·min-1；氫氣流量：40 mL·min-1；空氣流量：400 mL·min-1。

1.2.4 樣品測定

分別吸取不同濃度的乙醇標準系列工作液和處理后的試樣溶液，按1.2.3的色譜條件進樣測定，以乙醇濃度為橫坐標，以乙醇和內標峰面積的比值為縱坐標，繪制工作曲線。

2 結果與分析

2.1 溶解時間、保留時間

GB 5009.225—2016方法與優化后的方法內標物的溶解時間、保留時間以及乙醇色譜峰保留時間見表1、圖 1、圖 2。

從表1中可以看出，使用GB 5009.225—2016方法，試樣與內標物溶液混合時，溶解時間為6 min，這是由于內標選擇上的乙醇標準使用溶液濃度為2%vol～10%vol，為高水相溶液，選擇4-甲基-2-戊醇作為內標液，混合振搖后易形成油滴狀懸浮液分散在溶液和黏附容器壁上，導致溶解不完全，均勻性不佳。而使用優化后方法，試樣與內標物溶液混合時間為2 min，這是因為使用選擇叔戊醇作為內標物，能縮短溶解時間并提高溶解度，從而提高測量的準確度。

表1 溶解時間、保留時間對比表

從圖1、圖2中可知，乙醇保留時間約為4.2 min，優化后方法（使用叔戊醇作為內標物）內標物的保留 時 間 約 為 5.2 min。GB 5009.225—2016方 法（ 使用4-甲基-2-戊醇作為內標物）內標物的保留時間約為8.6 min。在保證分離度到達要求的前提下，優化后方法能夠減少內標物的保留時間，可有效提高檢測效率。

圖1 GB 5009.225—2016方法蘋果酒樣品色譜圖

圖2 優化后方法蘋果酒樣品色譜圖

2.2 色譜峰分離效果與精度

GB 5009.225—2016方法與優化后方法的色譜峰分離效果、線性和精度對比結果見表2、表3。從表2和表3數據可以看出，①色譜峰分離度：優化后方法的內標物更接近乙醇出峰。叔戊醇與相鄰峰分離度（分辨率）約為13.9；4-甲基-2-戊醇與相鄰峰分離度（分辨率）約為20.3，均滿足分離度≥1.5的要求。②線性相關系數：線性相關系數R越接近1.0，線性越好，測量結果越準確。GB 5009.225—2016方法的線性相關系數R為0.941 8，而優化后方法的線性相關系數R為0.998 8，說明優化后方法線性更好。③精密度對比：GB 5009.225—2016方法由于使用4-甲基-2-戊醇作為內標，存在溶解度問題，導致精密度較差，相對標準偏差為3.0%，而優化后方法使用叔戊醇作為內標，能夠避免出現GB 5009.225—2016方法存在的問題，使相對標準偏差降低到1.3%。

表2 色譜峰分離效果和線性表

表3 相對標準偏差表（n=6）

2.3 加標回收率

按1.2.2中進行前處理，當蒸餾液接近刻度時，取下容量瓶，待溶液冷卻到室溫后，添加相應體積的乙醇到容量瓶，用水定容至刻度得到3個不同水平的加標樣。對蘋果酒進行乙醇加標回收率的試驗，分別向試樣溶液添加0.5%vol～2.0%vol的乙醇，使用優化后方法的回收率為99.0%～102.0%，而使用國標方法的回收率為93.0%～108.0%，說明使用優化后方法加標回收率更理想。3個水平加標回收率見表4。

表4 3個水平加標回收率表

優化后方法除了適用于測定果酒中的乙醇含量外，還適用于葡萄酒和啤酒中乙醇含量的測定。參照上述優化后的方法對葡萄酒或啤酒進行乙醇含量的測定，結果表明，在線性、分離度、精密度和加標回收率等指標優于GB 5009.225—2016的方法。

3 結論

《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225—2016）中，由于內標物在水中的溶解度較低導致標準曲線的線性、精密度和回收率等各方面均較差，且選用的內標物本身保留時間較長不利于提高檢測效率。研究通過優化色譜條件以及選擇叔戊醇作為內標物，能夠加快標準溶液和樣品處理過程，使標準溶液和樣品溶液更加均勻，縮短了樣品處理時間，提高了測量的準確度，為酒類中乙醇含量的測定提供了一種有效途徑。