雙酶法制備羊棲菜多肽的工藝研究

◎ 李愛英，馮秀靜，龐庭才

（1.崇左幼兒師范高等專科學校，廣西 崇左 532200；2.北部灣大學，廣西 欽州 535000）

羊棲菜（Sargassum fusiforme），別名海大麥[1]，屬于海洋藻類植物，藻體黃褐色，肥厚多汁。羊棲菜營養豐富，富含多種對人體有益的微量元素和某些特殊的生物特性，長期食用能使人的皮膚光滑滋潤，羊棲菜中的多糖對腫瘤具有免疫力[2]，能促進造血功能和防止高血壓[3]，適量食用羊棲菜可改善咽喉腫痛、口舌生瘡的癥狀。

我國的羊棲菜雖然資源豐富，但是由于新鮮的羊棲菜不利于長期儲藏和運輸，因此不能滿足消費者的需求，為了充分利用羊棲菜豐富的營養成分和藥用價值，將羊棲菜的蛋白質提取出來并通過甲醛滴定法[5-7]測定其水解度，研制出精深加工的營養保健酒品[8-9]，力求最大限度地利用其營養成分，擴大消費區域，滿足全國人們不斷增長的營養需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜，廣東雷州半島2015年所產；標準氫氧化鈉、中性甲醛溶液、百里酚酞、中性紅指示劑，廣州凱爾化工科技有限公司；堿性蛋白酶（20萬U·g-1）、木瓜蛋白酶（6萬U·g-1），南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超高速多功能粉碎機，市康市善竹貿易有限公司；數顯恒溫水浴鍋，上海躍進醫療器械有限公司；磁力攪拌器，上海龍躍儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藻蛋白水解的工藝流程

藻蛋白水解的工藝流程：曬干的羊棲菜用自來水浸泡0.5~1 h→清洗→石油醚回流→粉碎、過篩、浸提→離心、沉淀→成品羊棲菜蛋白→雙酶水解藻蛋白。

1.3.2 水解度的測定

采用甲醛滴定法[4]測定水解度。水解度（Degree of Hydrolysis，DH）計算公式如下所示：

式中：C-NaOH標準溶液的濃度，mol·L-1；V-酶解液消耗NaOH標準溶液的體積， mL；V0-未酶解液（空白）消耗NaOH標準溶液的體積，mL；0.014-氮毫克當量；N-底物樣品總氮含量，g。

1.3.3 單酶和雙酶分別對羊棲菜蛋白水解度大小的比較

取同質量的羊棲菜蛋白質溶于蒸餾水，分別加入單酶（堿性蛋白酶/木瓜蛋白酶），并使用雙酶法A和雙酶法B處理羊棲菜蛋白，以水解度大小為指標進行比較試驗。

1.3.4 單因素設計試驗

根據不同因素對水解度的影響，選取水解溫度、時間、pH、酶底比4個因素，進行單因素試驗[8]。

1.3.5 響應面試驗設計

從4個單因素中選出條件最佳，以酶底比A、溫度B、pHC、時間D為自變量，水解度為響應面值，采用4因素3水平進行響應面分析優化，見表1。

表1 響應面分析因素和水平表

2 結果與分析

2.1 單酶和雙酶對羊棲菜蛋白水解度大小的比較結果

由表2可知，雙酶法B水解羊棲菜蛋白所得的水解度最高，說明雙酶法比單酶法效果更好。對雙酶法的比例進一步探究，且由表3可知，兩種酶比例為1∶1時，水解效果更好。根據酶具有專一性的特點進行分析，第二種酶是利用第一種酶水解后的產物進行水解，第二種酶對前一種酶未水解完全的羊棲菜蛋白進行水解，不同的酶對蛋白質水解產物的方式不同，這都會使蛋白水解度得到提高，使羊棲菜蛋白水解更加徹底。

表2 酶量的確定表

表3 雙酶法的用量確定表

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 酶與底物濃度的比例對水解程度的影響

由圖1可知，隨著酶與底物濃度的上升水解度愈加明顯，酶底比為4%增加到8%時水解度變化不明顯，原因是提取液基本達到飽和。當酶底比大于8%時，水解度呈下降趨勢。

圖1 酶與底物濃度的比例對水解程度的影響圖

2.2.2 溫度對水解度的影響

由圖2可知，水解度隨著溫度的升高而升高，到達一定溫度時水解度降低。溫度從50 ℃增加到60 ℃時水解度明顯大幅提高，說明加熱能使化學反應速率加快。在60 ℃時水解度達到最高值41.32%。當溫度從60 ℃到70 ℃時，水解度大幅度下降。

圖2 溫度對水解度的影響

2.2.3 pH對水解度的影響

由圖3可知，隨著pH的變化，水解度先提高后降低，當pH由5.5增加到6.5時，水解度達到最大值26.78%。當pH大于6.5時，水解度呈大幅度下降，原因可能是偏堿性環境下使酶的空間結構發生了改變，酶的活力部位處于離解狀態，因此影響到酶與底物的結合。

圖3 pH對水解度的影響圖

2.2.4 時間對水解程度的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，水解度先提高后緩慢降低，原因可能是部分底物蛋白質的結構被破壞，部分酶失活，影響了酶解效果，當酶解時間為180 min時水解度達到最大值42.56%，酶解時間繼續延長，水解度小幅度降低，由42.56%變化到37.62%。

圖4 時間對水解程度的影響

3 時間對水解程度的影響

3.1 響應面試驗結果分析

3.1.1 響應面結果

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken模型，以酶與底物比例A，水解溫度B，pH值C和水解時間D4個因素為自變量，并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，對自變量進行編碼，水解度為響應面Y值。通過軟件Design-Expert對響應面進行統計分析，同時對結果進行統計分析，結果如表4所示。

表4 響應面設計方案與結果表

3.1.2 回歸方程擬合及方差分析

軟件Design-Expert對響應面結果進行二次回歸分析，擬合得到回歸方程為：Y=41.56-0.33A+1.04B+0.74C-0.17D+0.47AB+0.017AC+0.39AD+0.063BC+0.095BD-0.81CD-0.50A2-1.80B2-1.68C2-2.12D2。

為了檢驗方程的有效性，對雙酶法水解羊棲菜蛋白的數學模型進行方差分析，結果如表5所示。由表5可知，模型一次項B影響極其顯著（P<0.01），一次項C影響顯著（P<0.05）；一次項A、D因素對水解度大小影響均不夠顯著。溫度對水解度大小的影響極其顯著；水解溫度、時間和pH的二次項對水解度大小比較顯著；二次交互項是不夠顯著的，由此可進行分析預測：時間、溫度、pH3個因素的交互項對雙酶水解羊棲菜蛋白水解度的影響顯著，各因素之間有交互作用[10]。從表5可以看出，各因素對羊棲菜蛋白水解度大小的影響排列順序為水解溫度＞pH＞酶底比＞水解時間。

表5 二次響應面回歸模型系數顯著性檢驗結果表

模型P=0.018 4＜0.05，這表明二次方差模擬顯著，對于回歸方程的失擬項檢驗P=0.067 6，不顯著，這說明試驗因數外的未知量干擾不大。回歸方程的負相關系數R2=0.879，說明響應面的回歸關系顯著，表明回歸方程與試驗情況擬合較好。說明了響應面回歸方程能預測雙酶水解羊棲菜蛋白水解度的變化，反映了水解度與pH、酶底比、溫度和時間存在密切的關系。

3.1.3 響應面圖分析

由響應面圖分析結論可知，羊棲菜蛋白質水解的最佳參數為酶底比6%,水解的溫度60 ℃，pH為6.5，時間195 min。

3.2 驗證性試驗

將響應面優化參數修正后，實際的操作條件為酶底比6%,水解的溫度60 ℃，pH為6.5，時間180 min。實際測得羊棲菜蛋白質的水解度為41.73%，與模型預測值相近。通過驗證試驗，羊棲菜蛋白的水解度為41.73%，與理論值41.82%的誤差0.09%。驗證了回歸模型預測個因素與提取率之間關系的可靠性。

4 結論與分析

本文通過因素試驗和響應面分析方法，對羊棲菜多肽的制備工藝進行優化分析，通過軟件Design-Expert的回歸模型得出最佳的工藝制備條件理論值為：水解溫度61.29 ℃、水解pH 6.62、水解酶底比5.76%、水解時間180 min、水解度為41.829 5%。考慮到實際操作過程的限制條件，在驗證試驗中把制備羊棲菜多肽的最佳工藝條件設為溫度60 ℃、水解pH 6.5、水解酶底比6 %、水解時間180 min，羊棲菜蛋白液的水解度為41.73%，與理論值誤差0.099 5%。各因素對羊棲菜蛋白水解度大小的影響排列順序為水解溫度＞pH＞酶底比＞水解時間。這說明影響酶活力的因素很多，其主要因素有溫度、pH和底物濃度，次要因素有時間和金屬離子等，這些因素通過破壞酶的空間結構和影響活性部位結合基團，使酶失去活性，或是通過破壞底物（蛋白質）的空間結構，使底物不能分解產物與底物進行化學反應。由于水解度的提高也會使羊棲菜蛋白轉化為小分子多肽的概率提高，肽的產率也相應增加，為提高產品的營養價值和藥用成分，并為進一步研制營養保健品或其他精深加工產品提供了途徑。