溫針灸對兔膝骨性關節炎軟骨中Bcl-2和Bax表達的影響

王 鐸，劉 娣，馬遇原，武永利，3

（1.寧夏醫科大學中醫學院，銀川750004；2.寧夏醫科大學總醫院中醫骨傷科，銀川750004；3.寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室，銀川750004）

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種軟骨細胞代謝異常導致軟骨組織損傷，軟骨層退變，引發關節功能障礙的疾病。目前研究表明，關節軟骨的退變對KOA發病有著重要的影響[1]。關節軟骨退變中，細胞凋亡對其病理變化的影響程度最為關鍵[2]。研究[3]發現，B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）和Bcl2-Associated X蛋白質（Bax）分別是Bcl-2家族蛋白中主要的凋亡抑制因子和凋亡促進因子，Bcl-2、Bax兩因子之間的相互影響對抑制細胞凋亡作用強弱起重要作用。并在研究中發現，溫針灸對于影響軟骨細胞的凋亡有著一定的作用[4]。故通過研究軟骨細胞中Bcl-2、Bax的表達，可以明確溫針灸在治療KOA過程中對Bcl-2、Bax的影響。本實驗通過制備KOA兔模型，并給予溫針灸等方法干預，探討溫針灸對KOA兔軟骨細胞中Bcl-2、Bax表達的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭雄兔40只，體質量2.5～3.0 kg，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，批號：SYXK（寧）2015-0001。動物全部分籠飼養于寧夏醫科大學動物實驗室，標準飼料，自由進食、飲水，并每日密切觀察實驗兔生存狀態。

1.2 實驗耗材與試劑

無菌針灸針（華佗牌，蘇州醫療用品廠有限公司，規格0.25 mm×25 mm）。清艾條（江蘇康美制藥有限公司，規格20 cm×2.1 cm，國藥準字Z32020253）。改良Lillie-Mayer蘇木素染色液（北京雷根生物技術有限公司，產品編號：DH0001）。EDTA脫鈣液（北京酷來博科技有限公司，產品編號：SL1 500-500 mL）。多聚甲醛（天津市大茂化學試劑廠，產品編號：3709）。兔Bcl-2抗體（北京博奧森生物技術有限公司，產品編號：bx-0032R）。兔Bax抗體（北京博奧森生物技術有限公司，產品編號：bs-0127R）。兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，產品編號：PV-9001）。HRP標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，產品編號：ZB-2301）。

1.3 實驗方法

1.3.1 KOA模型的制備 將6月齡普通雄性新西蘭兔分籠單獨適應性飼養5 d后，隨機挑選10只作為空白組，余30只予以右后肢伸直位石膏管型固定進行兔KOA造模，后隨機分為溫針灸組、阿侖膦酸鈉組、模型組每組10只；實驗共4組。新西蘭兔造模后密切觀察，一旦發現兔遠膝端腫脹、糜爛、石膏脫落及嚴重撕咬等現象，將該兔剔除，立即重新造模。兔造模2周模擬臨床前、中期KOA中老年患者，根據文獻持續固定4周后造模完成[5]，造模完成后，并隨機抽取2只造模兔進行HE染色驗證造模成功。

1.3.2 干預方法 造模完成3 d后，去除石膏，進行干預。溫針灸組：參照《實驗針灸學》在兔膝關節外側下緣凹陷處先定位“外膝眼”后參照人體穴位定位“鶴頂”“內膝眼”，放置兔架上予以溫針灸，每穴刺入3～5 mm，從上端點燃艾柱，每穴灸3壯，每日1次，每次15 min，由實驗人員密切觀察，7 d為1個療程，共治療4個療程；阿侖膦酸納組：使用150 μg·（kg·d）-1阿倫磷酸鈉溶液配比蒸餾水進行灌胃，療程4周；模型組：不予任何干預手段，每天在固定器上固定15 min；空白組：不予造模，不予任何干預手段，每天在固定器上固定15 min。

1.3.3 動物取材 在實驗完成1 d內采用空氣栓塞法將兔處死，打開兔膝關節腔，充分暴露關節軟骨，取右側脛骨。用生理鹽水充分沖洗后放入4%多聚甲醛中進行固定24～48 h后，放入15%EDTA脫鈣液（1周更換1次）中，石蠟包埋，后切片，用HE染色法觀察軟骨形態的變化及免疫組織化學檢測軟骨細胞中Bcl-2、Bax的表達。1.3.4 HE染色進行Mankin's評分 取石蠟切片依次置于二甲苯Ⅰ液和Ⅱ液、無水乙醇Ⅰ液和Ⅱ液、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇及蒸餾水，再依次置于改良Lillie-Mayer蘇木素染色液、鹽酸乙醇分化、蒸餾水反藍、伊紅染色液中，沖洗，脫水，透明，封片。用掃描光鏡在100、200、400倍光學顯微鏡下觀察軟骨結構、軟骨細胞、軟骨基質的變化，軟骨潮線的完整性。依據Mankin's評分標準進行評分[6]，分析軟骨損傷情況。

1.3.5 免疫組織化學檢測Bcl-2、Bax表達 取切片使用兔二步法檢測試劑盒檢測后封片，于掃描光鏡下選取5個高倍視野進行拍照，利用IPP 6.0圖像處理軟件進行分析，計算光密度（OD）值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSDt檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組兔脛軟骨組織病理改變及Mankin's評分

各組軟骨組織HE染色后光鏡下顯示，空白組軟骨滑膜表面完整、光滑，軟骨細胞排列正常、細胞核完整、無增生或減少，軟骨基質著色正常，潮線結構完整、清晰；模型組軟骨表面粗糙、少量缺損、有裂隙，軟骨細胞排列紊亂、細胞明顯減少，軟骨基質著色失染，潮線扭曲；阿侖膦酸鈉組軟骨表面毛糙、有裂隙延伸至軟骨下骨，軟骨細胞排列不均勻、細胞數量減少，軟骨基質著色較淺，部分區域可見雙重潮線；溫針灸組軟骨表面平整、無明顯缺損，細胞排列局部紊亂、數量無減少，軟骨基質著色不明顯，潮線結構清晰，見圖1。Mankin's評分結果，模型組評分高于空白組（P＜0.05）；溫針灸組及阿侖膦酸鈉組評分低于模型組，溫針灸組評分低于阿侖膦酸鈉組（P均＜0.05），見表1。

圖1 各組兔脛軟骨組織損傷狀況（HE×200）

表1 各組兔脛軟骨組織Mankin′s評分比較（±s）

表1 各組兔脛軟骨組織Mankin′s評分比較（±s）

與空白組比較*P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05；與阿侖膦酸鈉組比較◇P＜0.05。

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2.2 免疫組織化學檢測各組兔軟骨細胞中Bcl-2、Bax的表達水平比較

Bcl-2、Bax的陽性表達均定位于軟骨細胞的細胞質中，顯示為黃色或者棕黃色顆粒。空白組軟骨細胞中Bcl-2表達明顯，著色較深、分布密集，Bax基本無表達；模型組細胞中Bcl-2基本無表達，Bax明顯散在細胞質和細胞核中；阿侖膦酸鈉組中Bcl-2可見部分表達，著色較淺，Bax表達只見于部分散在軟骨表層；溫針灸組Bcl-2少見部分表達，顏色變淺，Bax表達散在淺表部位，著色較淺，見圖2、圖3。與空白組比較，模型組軟骨細胞中Bax表達升高；Bcl-2表達降低（P均＜0.05）；與模型組比較，溫針灸組和阿侖膦酸鈉組中Bcl-2表達升高，Bax表達下降（P均＜0.05）；溫針灸組與阿倫磷酸鈉組Bcl-2、Bax表達無統計學意義（P＞0.05），見表2。

圖2 各組兔軟骨細胞Bcl-2表達（免疫組化×200）

圖3 各組兔軟骨細胞Bax表達（免疫組化×200）

表2 各組軟骨細胞中Bcl-2、Bax表達比較（±s）

表2 各組軟骨細胞中Bcl-2、Bax表達比較（±s）

與空白組比較*P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05。

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3 討論

KOA是各種原因引起關節軟骨出現原發性或繼發性病理改變，致使關節出現疼痛、屈伸、活動不利等癥狀，從而影響膝關節功能的一種退行性疾病[7]。中醫學認為，KOA屬于中醫“痹癥”的范疇，《素問·痹論》中提出“風寒濕三氣雜至，合而為痹”的觀點[8]，其主要病證型為風寒濕滯證，治法應當散寒祛濕、溫陽補虛。溫針灸是針刺和艾灸相結合的一種治療手段，針刺的同時施予艾灸，既加強了針刺的刺激強度，又使艾灸的溫熱效應得到很好的傳遞，能夠達到良好祛風散寒除濕效果[9]。所以采用溫針灸治療KOA有著獨特的優勢。在臨床上，溫針灸治療KOA的療效也得到了肯定[10]。而現代醫學對于溫針灸治療KOA的機制尚未明確，只是近些年研究發現，軟骨細胞凋亡對于關節軟骨的損傷起著重要的作用[11]。

KOA發生、發展的主要病理變化是關節軟骨退變，關節軟骨的主要組成是軟骨細胞和細胞外基質。軟骨細胞的凋亡，是影響軟骨退變的重要因素[12]。所以，保證軟骨細胞的生存是防治KOA的重點。Bcl-2家族是調控細胞凋亡的主要蛋白，主要分為促凋亡蛋白（Bid、Bim等）、促凋亡效應蛋白（Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-x等）。研究表明[13-15]，Bcl-2與Bax通常以異源二聚體的形式存在，共同調節細胞凋亡，當Bcl-2表達高時，與Bax形成異源二聚體，抑制Bax形成，延緩細胞凋亡；Bax表達高時，形成Bax同源二聚體，誘發Cyt-C釋放，活化Caspase-9，使Caspase-9酶切Caspase-3酶原，激活Caspase-3，促使Caspase-3剪切，誘發細胞凋亡。Bcl-2和Bax兩種蛋白，在正常情況下以適當比例存在，共同參與細胞生理過程，在細胞凋亡發生時，二者的比例發生變化，使線粒體膜通透性增加，激活Caspase家族蛋白，致使凋亡加速發生[16]。研究[17]表明，Bcl-2在BCL-2家族中抗凋亡能力最強，Bax是主要的促凋亡因子。所以，Bcl-2和Bax的生成在KOA的發展進程中起著至關重要的作用。

本研究結果顯示，溫針灸及阿侖膦酸鈉干預后，KOA兔關節軟骨表面平整、細胞排列有序、細胞數目增多、Mankin's評分降低，表明溫針灸組與阿侖膦酸鈉組均可改善KOA軟骨損傷程度，對于治療KOA有著明顯的作用。通過免疫組化測量結果發現溫針灸及阿侖膦酸鈉治療KOA兔可引起Bcl-2及Bax表達發生變化，表明溫針灸與阿倫磷酸鈉均能在KOA發展過程中對Bcl-2、Bax表達產生影響，說明溫針灸可通過調控Bcl-2和Bax在軟骨細胞中的表達來阻止細胞凋亡的發生。此結果與王艦等[18]研究結果一致，證明溫針灸通過上調Bcl-2、下調Bax來抑制軟骨細胞凋亡，從而延緩KOA的發展進程。在KOA進程中調節Bcl-2、Bax表達可調控軟骨細胞凋亡水平，促進軟骨細胞修復和再生，以維持軟骨細胞的正常生存狀態，最終達到治療KOA的目的。

綜上所述，溫針灸能夠影響細胞凋亡在KOA進程中的發生，并有效地增強Bcl-2、抑制Bax在KOA中的表達，由此得出結論：溫針灸治療KOA的作用機制在于調控Bcl-2、Bax的表達來影響軟骨細胞的凋亡。在本課題組進一步探討的過程中，也發現了細胞凋亡與細胞自噬的發生有著密切的聯系，但其作用機制還尚未明確，故本實驗組將進一步探討溫針灸對細胞“自噬—凋亡”在KOA中的作用機制。