NLRP3 炎癥小體在A 型主動脈夾層形成中的作用機制探討

門 琛，邵永豐，馬路遙，黃浩斌，鄭翔翔（通訊作者）

（1 南京醫科大學第一附屬醫院老年科 江蘇 南京 210029）

（2 南京醫科大學第一附屬醫院心臟大血管外科 江蘇 南京 210029）

主動脈夾層（aortic dissection, AD）是主動脈疾病中最嚴重的一種臨床疾病，起病急、發展快、病情復雜、病死率和誤診率高。據主動脈夾層國際登記組織（International Registry of Acute Aortic Dissections,IRAD）分析，推算出男性發病率為16/10 萬，女性發病率為9.1/10 萬[1]。AD 的發病特點在于中膜病變，內膜撕裂而造成血液經撕裂口進入動脈壁中形成夾層。根據Stanford 夾層分型，A 型主動脈夾層（type A aortic dissection, AAD）累及升主動脈，也可累及主動脈弓、胸降主動脈和腹主動脈；Stanford B 型夾層累及胸降主動脈，可同時累及腹主動脈[2]。其中以AAD 最為危險，外科手術是其主要救治方法，但手術風險高，手術花費巨大。因此，如何預防AD 的發生發展，降低其病死率仍然是當前臨床醫療急需解決的問題。近年來不斷有研究證實了炎癥反應在主動脈壁重塑及夾層形成過程中起重要作用[3]。炎癥小體（Inflammasome）是一種調控IL-1β產生的大分子多蛋白復合體，NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD, ASC）和前體蛋白pro-Caspase-1 參與了NLRP3炎癥小體的組成。炎癥小體在自身免疫性疾病及血管粥樣硬化中的重要性已被充分證明[4]，但在主動脈瘤及主動脈夾層形成機制中研究較少。本研究旨在明確NLRP3炎癥小體在AAD 中的表達，探討其介導的炎癥反應在AAD 發生發展中的作用機制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月—2021 年1 月南京醫科大學第一附屬醫院心臟大血管外科收治的A 型主動脈夾層急診行升孫氏手術（升主動脈置換+主動脈弓替換+象鼻支架植入）的患者作為實驗組。對照組為同期在我在院行心臟移植的供體。兩組在年齡方面進行匹配，每組各15 例。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。排除標準：①發病至急診手術時間超過24 h；②患者有自身免疫性疾病、結締組織病或長期服用激素；③某些遺傳性疾病，如馬凡綜合征、先天性二葉式主動脈瓣；④慢性肝腎功能不全。本研究經南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理審批號：2020-SR-450），所有患者在入組前均簽署知情同意書。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 組織標本收集

AAD 組選取在升主動脈夾層破口附近的主動脈壁組織。主動脈壁組織離體后立即剔除外周脂肪及血栓，并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，一部分組織-80 ℃液氮保存，另一部分組織甲醛固定。對照組為在本中心行心臟移植，供心移植前修剪棄用的升主動脈壁組織，保存方式和AAD 組相同。

Western blotting。將主動脈組織剪碎，將其加入RIFA 裂解緩沖液取上清液。使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，上清液置于-70 ℃冰箱保存。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱后再取上清加樣后進行蛋白電泳。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，并轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）。分別加NLRP3、ASC、caspase-1、炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的特異性一抗4 ℃孵育過夜。經TBST 洗滌3 遍后，再與辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫反應，ECL 化學發光顯色。由自動曝光儀曝光拍照，用Image J 軟件（National Institutes of Health）對目標蛋白條帶進行分析。

1.3 免疫組化

免疫組化檢測主動脈壁樣品中CD68 細胞（巨噬細胞）。制備福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，并與CD68（Abcam, Cambridge, MA, USA）的一抗在4 ℃下溫育過夜，然后用二氨基聯苯胺染色，蘇木精復染。用蓋玻片安裝切片并在光學顯微鏡下檢查。用Olympus 顯微鏡對切片進行觀察、拍照。高倍鏡（×400）下觀察切片標本，應用圖像分析系統（Image-Pro plus, version 6.0, Media Cybernetics）測定陽性信號平均光密度值（IOD/area）作為陽性染色的表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理。正態分布的計量資料采用均數±標準差（± s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用頻數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組患者主動脈壁炎癥小體及相關炎癥因子表達水平比較

AAD 組患者主動脈壁中炎性小體的組成成分，即NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。AAD 組主動脈壁中炎性細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組升主動脈壁組織中炎性小體及炎癥因子表達水平比較（± s）

表2 兩組升主動脈壁組織中炎性小體及炎癥因子表達水平比較（± s）

AAD 組對照組tP NLRP3140.5±12.1109.6±9.77.780.035 ASC243.4±14.690.7±4.233.100.012 caspase-1167.7±21.1 103.2±12.210.240.029 IL-1β140.2±17.6119.3±5.63.590.042 IL-6155.0±23.6111.3±4.15.950.034 TNF-α132.5±11.498.5±9.47.430.031

2.2 兩組患者主動脈壁CD68 表達水平比較

AAD 組患者升主動脈組織中CD68（5.31±0.51），免疫組化定量分析其表達量高于對照組的（1.23±0.11），差異有統計學意義（P= 0.006），即AAD 患者升主動脈壁的炎性表達較對照組更加明顯，炎癥反應在AAD 患者主動脈血管平滑肌組織上有明顯的表現。見圖1。

圖1 主動脈平滑肌組織中CD68 分布（×400）深色為CD68 分布的區域

3.討論

動物及人體研究均發現，主動脈夾層發生時血管局部炎癥反應增強，表現為大量單核巨噬細胞、多核白細胞及T/B 淋巴細胞浸潤，血管平滑肌細胞（vascularsmooth musclecells, VSMC）凋亡相關miRNAs 表達增多，炎癥相關miRNAs 水平顯著增加[5-6]。本文結果觀察到AAD 患者的主動脈平滑肌組織中性粒細胞及單核細胞浸潤均較對照組顯著升高，炎性細胞標記物CD68 的表達量也明顯增加。本實驗發現AAD 患者主動脈平滑肌中炎性小體組成蛋白NLRP3、ASC、caspase-1 的水平明顯升高，其下游炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平也顯著升高。這些結果表明NLRP3 炎癥小體活化，下游炎性細胞因子釋放增加介導了主動脈血管平滑肌的炎癥反應，最終導致了AAD 的形成。因此我們推測炎癥小體在這種炎癥介質反應的主動脈平滑肌細胞中的表達上調可能是導致AAD 炎癥機制的一個重要調控點。

綜上所述，炎癥小體可作為探索A A D 中導致血管平滑肌細胞增殖和遷移，主動脈血管重塑的信號傳導和功能機制研究的新靶點，并且可以作為預測主動脈夾層病變發展的新型生物標志物和藥物治療A A D 的新靶點。