石斛無菌播種及培養

王蓮輝

石斛（Dendrobium）屬于蘭科植物，全球約1500種，中國近80種。生于海拔480～1700米的山地林中樹干上或山谷巖石上，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶，澳大利亞和太平洋島嶼，我國大部分分布于西南、華南、臺灣等地。

石斛是世界上著名的觀賞蘭花，具有靚麗的容顏，葉披針形，莖肉質稍粗狀，花葶從葉腋抽出，花單朵至數多不等，每花3萼片和3花瓣，呈喇叭狀散開，色彩斑斕，花型奇特，馥郁芬芳，許多種類還具有極高的藥用價值。

貴州省林業科學研究院在石斛資源收集的基礎上，針對價值較高的一些種諸如鐵皮石斛、球花石斛，扭瓣石斛、翅萼石斛、晶帽石斛、金釵石斛、密花石斛、鼓槌石斛等開展了相關研究。

人工授粉

選取生長健壯的石斛母株，觀察石斛花苞的生長狀態，接近開放時去雄套袋，待花開5～7天人工授粉，用鑷子摘取成熟且具粘性的花粉粘貼于雌蕊柱頭上，2～3天花瓣閉合，子房膨大，每種石斛果實成熟期不同。

蒴果采收

無論是昆蟲充當媒介還是人工扮演昆蟲的角色，只要授粉成功，歷經120～180天的等待，種子孕育初見成效，成熟時蒴果由硬變軟，顏色由綠變黃即可采收作為外植體。

試驗過程

培養基的配制

石斛播種的培養基多種多樣，不同品種的最適培養基不同，有些品種加入天然有機物時，能提高種子萌發率，并加快萌發速度和生長速度，這一添加物的運用廣泛運用。

石斛的培養基采用M S、1/2MS、KC、花寶3號（3g/L）等為基本培養基，附加細胞分裂素（6-BA、KT、TDZ等）、生長素（α-NAA、IAA、IBA等）及天然有機物（椰乳、香蕉、馬鈴薯、蘋果汁等），所有培養基均按每升葡萄糖30g（生根20g）和瓊脂6g作為固定劑，加熱完全融化，用0.1mol/L的HCl或NaOH調整pH值在5.2～5.4之間，分裝入培養瓶，每瓶40～50ml，用封口膜或塑料瓶蓋封口，每一處理20～25瓶。

培養基的消毒

由于培養基含豐富的營養成分，適宜多種細菌和真菌的生長和繁殖，極易造成污染，影響組培的成功，因此培養基消毒是必不可少的，常用的消毒一般采用高溫高壓消毒法，將盛裝一定量培養基的培養瓶放置于蒸氣高壓滅菌鍋內，設定1.05kg/ cm的壓力，溫度121.3℃，維持20～30min，室溫冷卻后待用。

無菌材料的獲得及播種

由于石斛胚發育不完全，在自然狀態下繁殖困難，需與真菌共生才能發芽，存在種子萌發率低，成苗率低的問題，因此不能像其他植物一樣在大田或苗床上播種，因此可運用生物技術手段在添加各種營養素的無菌培養基上，采用蘭花的無菌播種與試管快速成苗技術促進其萌發生長成苗，在短時間內滿足大規模種植種植需求。

無菌播種：建立無菌培養物的過程如下，首先要進行外植體的表面滅菌，待石斛果實成熟未開裂時，剪取果實放在自來水下沖洗表面的臟物2～3小時，將上下兩端切除，置于超凈工作臺上。選用飽滿的果實用75%的酒精浸泡20-30秒，再用5%～10%次氯酸鈉（NaClO）處理10分鐘，最后用0.1%升汞（HgCl2）消毒5分鐘，或3%雙氧水溶液消毒 5～20分鐘，以無菌水沖洗數4～5次。

在操作前準備好所有滅菌工具，保持超凈工作臺的無菌狀態，用無菌濾紙擦干果實后，用解剖刀剝開果皮，用接種針將黃色粉末狀胚均勻地撒播于培養基上，播種密度以每瓶數量大致能接觸到培養基為宜，太密時會影響發芽率及發芽后的正常生長，播種后稍加振動，使種子充分散布于培養基中。

培養條件：試驗材料的各種培養是在培養室內進行的，溫度維持在23～25℃。將播種后的玻璃瓶放置于帶有兩支40W日光燈的培養架上，光照強度30～40μmol.m-2.s-1，時間12h. d-1，溫度過高易褐變死亡，溫度過低發芽慢。

原球莖培養：石斛種子在所配制的MS或1/2MS添加α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養基上，接種2～3周胚明顯增大，形成白色原球莖，4～5周原球莖轉綠，7～8周種胚突破種皮，部分頂端出現綠色葉原基，球體基部有絲狀毛。

增殖培養：為獲得更多的種苗，將混合有葉原基和原球莖的組織接種于MS或1/2MS添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）1-3mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養基上，3～5周，原球莖伸長長大，葉片從原球莖頂部生出，7-9周第2及第3片葉長出并呈3～5株的叢生帶短根的小苗。

壯苗生根：隨著幼苗的生長，分瓶移入另外的培養基中，給予充足的生長空間，形成能用于栽培的植株。將長成的叢生植株分開接種到1/2MS或1/4MS添加吲哚乙酸（IBA）0.05～0.5mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培養基上，一般每瓶接種15株左右，經5～7周幼根長長，8～10周長成具2-3條根、3～4片葉的完整植株。

練苗及移栽：基質選擇：通過查閱有關資料及多年從事組培小苗的培育經驗，結合石斛的生長習性對基質的要求（疏松、透氣、排水），選擇石斛組培苗煉苗基質以碎樹皮+植金石+水苔等混合為宜。

基質消毒：用高錳酸鉀1000倍液對所選基質進行消毒處理，并放置于太陽下進一步爆曬，裝育苗盤待用。

當石斛小苗長到3～5cm時，可移出培養瓶。出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7天，然后將其從玻璃瓶中取出，用水輕輕清洗根部的培養基，用鑷子栽于育苗盤中，每盤120叢，而后放在25℃左右的溫室內，保持較高的空氣濕度和較強的散射光，每周施一次液面肥并噴灑抗菌劑，2個月后可按常規的日常管理即可。