高山杜鵑離體葉片高效再生及其再生途徑研究

彭綠春，廖多思，解瑋佳，宋 杰，蔡艷飛，張 露，李世峰

（1云南省農業科學院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心/云南省花卉育種重點實驗室/云南花卉技術工程研究中心，昆明 650205；2寧南縣林業和草原局，四川 涼山 615400）

0 引言

杜鵑花屬是世界著名的木本花卉。高山杜鵑是指利用杜鵑花屬中常綠杜鵑亞屬種質資源育成的一些革質、常綠、花冠碩大的品種類型[1]，其觀賞價值高，近年來成為中國年宵花和高檔園林造景的新秀，高山杜鵑新品種培育在國內也日益引起重視[2]。因在打破種間雜交障礙、定向選育方面較常規雜交育種表現的優越性，基因工程技術已成為現今杜鵑花育種的熱點問題[3]。葉片是遺傳轉化和細胞操作的常用受體材料[4-6]，建立高效、穩定的離體葉片再生植株體系和發掘再生能力強的基因型，是杜鵑花基因工程育種成功的關鍵。

目前，杜鵑花植株離體再生方面的研究很多，但以離體葉片為材料進行的植株再生研究較少，主要涉及基本培養基類型、激素種類和濃度等方面[7-9]。研究認為低鹽濃度的Anderson培養基、Read培養基和WPM培養基適用于大多數杜鵑的離體培養[10-12]。外源激素的選用主要是TDZ和ZT，且針對不同基因型杜鵑花離體葉片再生，2種激素誘導效果差異大。Zaytseva等[13]用 TDZ誘導Rhododendron sichotense和Rhododendron catawbiense‘Grandiflorum’的離體葉片再生不定芽，再生頻率分別達93%和85%，且再生的芽均起源于葉片近軸面的表皮細胞，但前者來源于突起，而后者來源于胚狀體結構。劉燕等[14]認為TDZ較ZT和2-iP更有利于桃葉杜鵑誘導愈傷組織。汪玲敏等[15]則認為誘導云南杜鵑離體葉片直接再生芽ZT作用好于TDZ，再生芽率為74%。呂秀立等[16]應用ZT誘導大葉常綠杜鵑離體直接再生不定芽率為70%。Pavingerova[17]以不同濃度TDZ誘導15個杜鵑栽培種離體葉片再生不定芽的研究發現，不同基因型所需TDZ濃度不同，且不定芽的再生頻率從0%到100%差異很大。為建立高效、穩定的杜鵑離體葉片植株再生體系，一方面有必要針對特定種和基因型開展植株再生研究，一方面還需篩選再生能力強的基因型應用于遺傳轉化。

本研究以6個高山杜鵑品種為材料，研究不同濃度TDZ和ZT對其離體葉片再生效率的影響，篩選出再生能力強的基因型，并通過再生過程形態學和組織細胞學觀察對再生途徑進行初步研究，以期為高山杜鵑離體葉片再生芽機理研究，提高其植株再生頻率和遺傳轉化效率提供技術支持和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2018年6月—2019年12月在云南省農業科學院花卉研究所云南省花卉育種重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

試驗材料為云南省農業科學院花卉研究所組織培養實驗室中保存的6個高山杜鵑品種的增殖瓶苗，分別 是‘Percy Wiseman’(D4)、‘Cunnigham’s White’(W10)、‘Halfdem Lem’(W17)、‘Madame Masson’(W22)、‘Scintillation’(W29)、‘XXL’(X)。

1.3 試驗方法

1.3.1 不定芽誘導培養 以增殖培養30天的高山杜鵑瓶苗為材料，取植株頂部往下完全展開的第1和第2輪葉片，葉背劃3條傷口，背面朝下接種于附加不同濃度ZT、TDZ和NAA的誘導培養基，激素配比見表1，每個配方接種3皿，每皿7個葉片。接種后每隔1天觀察記錄每個品種在不同濃度激素處理下的分化時間和分化的葉片數（葉片上只要有不定芽長出，則該葉片為分化的葉片），培養50天后，統計分化葉片數并計算分化率[式(1)～(2)]；此時將試驗材料轉接到相應處理的新鮮培養基，再培養40天后，計數不同處理下各品種分化芽的數量[式(3)]。

表1 離體葉片誘導芽激素組合 mg/L

誘導培養基以WPM為基本培養基，附加不同配比的激素，蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH 5.4，121℃高壓滅菌25 min。培養光照強度2000 lx，光照時間12 h/d，培養溫度(25±2)℃。

1.3.2 離體葉片分化不定芽形態及組織細胞學觀察 接種后，用體視鏡觀察離體葉片的形態響應，接種后至培養第30天隔1天觀察，培養30天后隔5天觀察，記錄離體葉片分化芽的時間和形態學特征。離體葉片分化形成完整的不定芽之前，每次觀察時取培養中的葉片進行石蠟切片，觀察葉片分化過程中的組織細胞學變化，石蠟切片制作參照Zaytseva1等[13]的方法進行。

1.4 數據處理

原始數據用Excel統計、計算，采用SPSS Statistics 18.0軟件分析不同處理間分化率和分化不定芽數的差異顯著性，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 激素種類和濃度對高山杜鵑離體葉片再生芽效率的影響

2.1.1 分化率 表2結果顯示，不添加外源細胞分裂素即可一定程度誘導6種高山杜鵑離體葉片切口處的膨大反應，并最終有極少量不定芽形成。從分化率看，TDZ濃度為0.04 mg/L時，除D4和W22外其余品種的不定芽分化率均可達到100%。而D4和W22的分化率也是隨TDZ濃度增加而提高，分別于0.08、0.06 mg/L時達到100%。ZT對6個基因型高山杜鵑離體葉片不定芽的誘導效果顯著弱于TDZ。隨ZT濃度增加，各基因型葉片的分化率提高。當ZT濃度為4 mg/L時，W10、W17、W29、X分化率與TDZ 0.04 mg/L處理無顯著差異，但D4和W22的分化率顯著低于TDZ處理。

表2 不同處理對6種高山杜鵑離體葉片分化率的影響%

從響應時間來看，在各自分化率最高的TDZ濃度下，W10、W29和X的響應最早，培養3～5天即可見葉片切口的膨大反應（圖1）。W29培養18天后離體葉片即全部開始分化不定芽，X培養20天后分化率達100%，W10培養22天后全部分化，W17培養28天后葉片分化率達100%，而W22和D4葉片培養35天后分化率達100%。雖然6個基因型高山杜鵑的葉片分化率均達到了100%，但其分化出的不定芽狀態有差異，且從離體葉片對外源TDZ的反應時間看，W29最早，W10和X稍晚，再次是W17，W22和D4最晚。

圖1 不同基因型高山杜鵑離體葉片分化趨勢

2.1.2 再生不定芽數量 從表3可看出，各基因型中，TDZ誘導的不定芽數量顯著高于ZT。對于同一個基因型，不同TDZ濃度下離體葉片分化不定芽的數量表現出差異，隨濃度升高，芽數量呈先增加后降低的趨勢，其中，D4、W17、W29、X在TDZ為0.06 mg/L時分化的芽數最多，顯著多于其他處理，W10和W22在TDZ 0.04～0.06 mg/L時分化的芽數最多，顯著多于其他處理。各基因型高山杜鵑中，W10離體葉片誘導出的不定芽最多，平均達13個/片，而X誘導出的芽數最少，平均只有5.67個/片。通過形態觀察發現，各基因型在TDZ濃度高于0.06 mg/L時，可分化出大量密集的芽點，但這些芽點大部分不能伸長生長發育成正常的芽，故統計其分化的芽數量反而降低。

表3 不同處理對6種高山杜鵑離體葉片分化芽數量的影響 個/片

2.2 高山杜鵑離體葉片再生芽途徑

對離體葉片再生過程的形態學和組織細胞學觀察發現，在TDZ和ZT誘導下，W10、W29、X和 W17通過器官直接發生途徑再生不定芽，而W22和D4除了器官直接發生途徑外，在TDZ誘導下存在少量葉片通過愈傷組織間接再生途徑分化不定芽。

高山杜鵑離體葉片由上下表皮、柵欄組織、海綿組織和維管組織組成（圖2G）。器官直接再生途徑中，離體葉片接入培養基后，切口處日益膨大（圖2A），此時葉片上表皮細胞及其以下的數層細胞分裂活躍，細胞染色深，處于脫分化狀態（圖2H）；培養10～13天時，這些細胞經過多次分裂，突出表皮，形成染色深的近球形的分生細胞團（圖2I、J），即為葉片切口膨大處觀察到透明的不同大小的球形突起（圖2B）；隨培養時間延長球狀突起長大，變綠或變紅（圖2C），培養約15天后，突起進一步長大、分化，可見葉片表面分化出不同發育階段的芽點（圖2D、E、K）；最后芽點長成結構完整的不定芽，整個葉片上長出叢生的小植株（圖2F）。

圖2 0.04 mg/L TDZ誘導下，R.‘Scintillation’(W29)離體葉片直接再生芽的形態和組織細胞學觀察

在離體葉片培養的初始階段，愈傷組織間接再生途徑與直接再生途徑一樣經歷了切口處膨大、細胞分裂活躍和增殖（圖3A，H），與直接途徑不同的是間接途徑葉片切口處持續膨大，大約培養16天時形成愈傷組織（圖3B）。愈傷組織來源于葉片上表皮細胞及其以下的幾層細胞的增殖，突出的愈傷組織細胞排列松散，細胞染色有深有淺（圖3I）。隨培養時間延長，有的愈傷組織褐化、干枯，最后死亡（圖3F、G），培養約25天時，在愈傷組織細胞染色深的區域分化形成突出的細胞團（圖3J），即愈傷組織上形成的突起結構（圖3C），之后這些突起進一步分化、長大，形成芽（圖3D、K、L），離體葉片在培養約65天后通過愈傷組織間接途徑形成不定芽（圖3E）。

圖3 0.08 mg/L TDZ誘導下R.‘Percy wiseman’(D4)離體葉片愈傷組織途徑再生芽的形態和組織學觀察

3 結論

TDZ誘導6種高山杜鵑離體葉片再生的效果好于ZT。TDZ濃度為0.04 mg/L時，‘Cunnigham’s White’(W10)、‘Halfdem Lem’(W17)、‘Scintillation’(W29)、‘XXL’(X)不定芽分化率達到100%，TDZ濃度分別為0.08、0.06 mg/L 時‘Percy Wiseman’(D4)和‘Madame Masson’(W22)的分化率為100%；‘Cunnigham’s White’離體葉片誘導出的不定芽最多，平均達13個/片，而‘XXL’誘導出的芽數最少，平均只有5.67個/片；離體葉片分化芽的響應時間‘Scintillation’最早，‘Cunnigham’s White’和‘XXL’稍 晚 ，其 次 是‘Halfdem Lem’，‘Madame Masson’和‘Percy Wiseman’最晚。6個基因型都可作為遺傳轉化的候選材料，其中‘Scintillation’、‘Halfdem Lem’和‘Cunnigham’s White’的再生能力更強。6種高山杜鵑離體葉片的再生途徑主要為器官直接再生，其中‘Percy Wiseman’和‘Madame Masson’除器官直接發生途徑外，在TDZ誘導下有少量葉片存在愈傷組織間接再生途徑分化不定芽。研究結果為高山杜鵑離體葉片再生芽機理研究，提高其植株再生頻率和遺傳轉化效率提供技術支持和試驗基礎。

4 討論

基因型是影響植株再生的關鍵因子[18-19]。本研究中6種高山杜鵑離體葉片在TDZ處理下分化率均可達到100%，表明它們可作為高山杜鵑遺傳轉化應用的候選材料。

TDZ和ZT是杜鵑屬植物組織培養中應用較多的植物激素，具有較強的細胞分裂素活性[20]，但兩者對杜鵑屬不同種植物組培苗增殖和離體葉片分化的效應有差異[14-15]。本研究中，從離體葉片的響應時間、分化率和分化芽數看，TDZ對6種高山杜鵑離體葉片分化芽的效果均好于ZT，只是不同基因型所需的TDZ濃度有差異。而云南杜鵑、大葉常綠杜鵑的研究中又認為ZT對葉片分化的效果好于TDZ。吳曉軍等[19]在小麥成熟胚再生體系中認為，胚處理方式與基因型之間可能存在著一定的互作關系，找到最適合的胚處理方法，可將基因型的再生能力最大化。在考慮到基因型間差異的同時，本研究中觀察到一定濃度TDZ能誘導大量不定芽，但芽體大多短縮，最終不能形成正常的芽和植株。劉淼等[21]在牛皮杜鵑分化芽的研究中發現，TDZ對組培苗愈傷組織誘導及分化的效果顯著優于ZT，但繼代培養時增殖效果不如ZT。可見，在前期應用TDZ高效誘導離體葉片分化芽點的基礎上，后續有必要進一步研究在培養的不同階段組合低濃度ZT對芽點成芽的作用。

高山杜鵑離體葉片可通過器官直接或間接發生[22-23]和體細胞胚胎發生[24]2條途徑再生不定芽，再生途徑除與基因型有關，還與外源植物生長調節劑刺激下的內源激素水平密切相關。羅彭等[25]采用0.8 mg/L TDZ結合0.2 mg/L NAA誘導大白杜鵑、美容杜鵑、喇叭杜鵑愈傷組織，愈傷組織可分化叢芽。而本研究中，雖然6種高山杜鵑器官直接發生頻率均達到100%，但‘Percy Wiseman’、‘Madame Masson’所需TDZ濃度分別為0.08、0.06 mg/L，較其他基因型高，且除器官直接發生途徑外，還存在少量愈傷組織間接再生途徑。說明在不同濃度外源激素誘導下，高山杜鵑再生可能存在不同途徑。故后續可針對特定基因型和特定植株再生處理方法，探討離體葉片再生不同階段的形態和組織細胞發育動態，以提高植株再生頻率和遺傳轉化效率。