梨花和油菜花揮發性氣味物質的鑒定及差異分析

郭 媛，郭寶貝，張旭鳳，王冰霞，武文卿，宋懷磊，鄭永惠

（1山西農業大學園藝學院，太原 030031；2山西農業大學果樹研究所，太原 030031；3運城市鹽湖區果業發展中心，山西 運城 044000；4山西省晉中種蜂場，山西 晉中 030600）

0 引言

蟲媒植物與傳粉昆蟲在長期的協同進化過程中形成了互惠互利的關系[1]，蟲媒植物通過顏色、氣味等植物性狀引誘傳粉昆蟲幫助其完成傳粉受精的繁育進程[2]，昆蟲獲得花蜜、花粉等物質回報，因此這些因素直接影響訪花昆蟲的拜訪行為及傳粉效率[3-4]。其中花朵氣味是吸引傳粉昆蟲到訪，獲得傳粉、受精的重要化學信號[5]。每種蟲媒植物都有其獨特的氣味，本質上是通過散發的揮發性物質吸引傳粉昆蟲[6-7]或者趨避害蟲[8-9]。許多學者研究了植物揮發性物質對于昆蟲的引誘或者趨避作用，表明其在吸引昆蟲傳粉[10]、草食性昆蟲取食[11]、寄主嗅覺定位[12-13]、植物防御行為[14-15]等方面均發揮著重要作用。

梨是中國第三大水果，僅次于蘋果、柑橘。據聯合國糧農組織(FAO)數據庫最新數據顯示，截至2017年，國內梨栽培面積約96萬hm2，總產量約1653萬t，面積和產量均據世界首位[16]。梨屬于典型的蟲媒植物，其配子體自交不親和，自花授粉結實率低[17]，而且由于其花粉粒大[18]、粘性重，自然界的風力不能很好的傳播，需要依靠昆蟲來傳粉。已有研究表明，梨樹通過昆蟲傳粉可以顯著提高坐果率[19]、增加產量，同時提升果實的商品性狀[20]。但自然界中，昆蟲并不喜歡采集梨花，尤其是存在其他競爭植物同期開花時，訪問梨花的昆蟲數量急劇下降[21]。梨花花粉量大且有花蜜分泌，在一定程度上這些物質回報可以達到吸引傳粉昆蟲并順利實現授粉的目的[22]。油菜作為一種重要的蜜源植物，2017年全國總播種面積和總產量分別為665.30萬hm2和1327.41萬t[23]。現今存在的種植模式中，油菜與梨樹常出現花期重疊，因此，油菜是梨樹花期傳粉昆蟲采集的主要競爭植物[21]。因此對同期開花的梨花和油菜花揮發性氣味物質成分的鑒定并進行比較分析，以期了解梨花和油菜花吸引傳粉昆蟲的采集行為機理，解決梨樹花期授粉難題。

1 材料與方法

1.1 取樣時間

2017、2018年3月25日—4月15日。

1.2 取樣地點

梨花樣本是采自山西省運城市鹽湖區鴻芝驛鎮孫余村的酥梨(Pyrus bretschneideri)，油菜花樣本是采自山西省運城市鹽湖區三路里鄉三路里村的甘藍型油菜(Brassia campestris)。

1.3 取樣方法

1.3.1 花朵取樣 梨花朵于2017年3月25—27日取樣。油菜花朵于2018年3月28—30日取樣。試驗時間內每日9:00—18:00，選擇當天剛開、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵整花取下，放入取樣瓶中并冷凍保存。每1 g為一個樣本，3次重復。

1.3.2 花藥取樣 取樣時間同花朵取樣時間。選擇當天開放、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵，用鑷子夾取未散粉花藥整個取下，放入EP管中冷凍保存，每1 g為一個樣本，3次重復。

1.3.3 花蜜取樣 梨花蜜于2017年3月25日—4月1日取樣。油菜花蜜于2018年4月8—15日取樣。試驗時間內每日9:00—18:00，用1 mm口徑毛細管從花朵基部蜜腺處吸取花蜜，吸滿1管，導入到1.5 mL EP管中冷凍保存，集滿1 g為一個樣本，3次重復。

樣本取樣完成后寄往上海生工生物工程（上海）股份有限公司進行花朵、花藥和花蜜中揮發性氣味物質的檢測。

1.4 固相萃取裝置

色譜儀(HP 7890Agas)，質量選擇性檢測器(5975C)，手動萃取固定器，萃取纖維(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，固相萃取試劑瓶(50 mL)，隔膜（18 mm×1.27 mm，聚四氟乙烯/硅膠），密封圈（鋁，中心開口式）。

1.5 試驗方法

萃取纖維在GC注射器中以不分流進樣模式270℃加熱1 h后，樣品轉移到固相微萃取試劑瓶的頂部，立即使用密封圈和隔膜封口。將裝有樣品的萃取瓶浸入80℃水浴中，用隔膜穿孔針刺破瓶隔，下壓活塞，使纖維置于頂端樣品之上，并在50℃下吸附30 min。完成后抽回纖維頭，并將萃取頭插入GC-MS儀的氣相色譜進樣口，推出纖維頭，250℃解吸5 min，完成進樣。

1.5.1 GC條件 DB-WAX彈性毛細管柱(60m×0.25mm×0.25 μm)，載氣He流量1.0 mL/min，不分流，進樣口溫度250℃。柱溫起始溫度50℃保持1 min，以6.5℃/min升至100℃，保持1 min；以10℃/min升至130℃，保持1 min；再以7℃/min升至150℃，保持1 min；最后以10℃/min升至250℃，保持5 min。

1.5.2 MS條件 接口溫度230℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃。40～550 amu之間全范圍掃描。

1.6 梨和油菜傳粉昆蟲調查方法

2017年3月25—27日選擇山西運城市鹽湖區泓芝驛鎮同期種植梨樹和油菜的地塊，梨樹選定3棵樹，油菜劃分5 m×10 m的觀察樣方，每天6:00—18:00網捕進入觀測樣地內的昆蟲，共調查3天，將田間采集的昆蟲裝入50 mL離心管中，實驗室內對昆蟲進行數量統計和分類鑒定。

1.7 數據分析

通過檢索NIST.11標準譜圖庫質量譜圖確定化合物，運用峰面積歸一化法求得各成分相對含量。用SPSS 22.0進行對梨花揮發性氣味物質進行主成分分析并得到相關主成分載荷矩陣。

2 結果與分析

2.1 梨和油菜全花、花藥和花蜜中揮發性氣味物質成分比較

由表1可知，梨花中共含有氣味物質9種，其中花藥含7種、花蜜含4種；2種植物中含共有氣味物質5種，分別是乙醇、十甲基環戊硅氧烷、十二甲基環六硅氧烷、十四甲基環庚硅氧烷和六甲基環三硅氧烷。油菜全花、花藥、花蜜中所含揮發性氣味物質種類均高于梨花，共含有氣味物質23種，其中花藥中含16種、花蜜中含5種；2種花中均是花藥比花蜜氣味物質更豐富。

表1 梨、油菜揮發性氣味物質成分及相對含量%

續表1

梨花中相對含量最高的是十二甲基環六硅氧烷、乙醇和苯甲醛。油菜花中相對含量多的是苯丙腈、十二甲基環六硅氧烷和5-氰基-1-戊烯。

2.2 梨花、油菜花揮發性氣味物質分類及比例分析

將梨花、油菜花中揮發性氣味物質進行歸類，由圖1～2可知，梨中氣味物質有氧烷類、醛類、酯類、醚類、醇類5類，氧烷類占44%以上，油菜花中最多的酯類物質梨花中沒有檢測到。油菜中氣味物質有10類，分別是酯類、氧烷類、腈類、硫醚、醛類、酸類、碳氧化物、醇類、烯類、氰化物，占比最多的是酯類和氧烷類。

圖1 梨花揮發性氣味物質比例分布圖

圖2 油菜揮發性氣味物質比例分布圖

2.3 梨花、油菜花揮發性氣味物質主成分分析

2.3.1 各指標的標準化處理 為防止所測數據在量綱和數量級上的差別對主成分分析造成影響，對數據進行了標準化處理，使所測數據具有可比性。數據處理方式依據式(1)進行。

2.3.2 梨花朵揮發性氣味物質主成分分析 從表2可以看出，第1主成分和物質1、2、6、7、8、9呈正相關，主要為氧烷類、酯類、腈類、醚類，和苯甲醛呈負相關，主要貢獻物為二甲基硫醚、十四甲基環七硅氧烷、苯丙腈、二氧化碳、乙醇、苯甲醛。第2主成分和十二甲基環六硅氧烷呈正相關，其也是第2主成分主要貢獻物。第1成分的貢獻率為75.98%，第2成分的貢獻率為24.02%。2個成分的累計貢獻率已經達到100%，說明該數據的變化趨勢符合分析要求。

表2 梨花花朵揮發性氣味物質主成分載荷矩陣

2.3.3 油菜花朵揮發性氣味物質主成分分析 從表3中可以看出，第1主成分和物質8、9、10、19、22呈正相關，主要為醛類、氧烷類、烯類、酯類等物質；和5、17、18呈負相關，主要為酯類、腈類和醚類；主要貢獻物為反-2-己烯醛、異硫氰酸-2-苯乙酯、4-異硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚和十八甲基環九硅氧烷。第2主成分與物質2、6、11、14呈正相關，主要為醇類、醛類和氧烷類；與物質15、16、20、21呈負相關，主要為酸類、醚類和酯類物質；主要貢獻物為乙醇、甲基烯丙基氰化物、辛酸、癸酸甲酯和二甲基四硫醚。第1成分的貢獻率為51.523%，第2成分的貢獻率為48.477%。2個成分的累計貢獻率已經達到100%，因此該數據的變化趨勢能較好地反映原始信息，符合分析的要求。

表3 油菜花花朵揮發性氣味物質主成分載荷矩陣

2.4 梨花、油菜花氣味物質與傳粉昆蟲相關性分析

傳粉昆蟲調查發現試驗地共有傳粉昆蟲4目10科11種，但梨和油菜傳粉昆蟲數量有顯著差異(P<0.05)。梨樹平均每天有傳粉昆蟲20只，油菜每天平均有196只。將梨、油菜花朵所含揮發性氣味物質成分與傳粉昆蟲數量進行相關性分析，并未發現各種成分與昆蟲數量呈顯著相關性。

3 結論與討論

異花授粉植物與傳粉昆蟲協同進化的過程中，通過花朵形態、顏色、大小、氣味、分泌花蜜、散發花粉等方式來吸引傳粉昆蟲，其中除了花蜜、花粉等食物報酬的因素，一些昆蟲主要通過嗅覺而不是視覺吸引進行傳粉[24]，不同的傳粉昆蟲對氣味敏感度也有很大差異[25]。油菜花氣味物質成分種類和數量均比梨花豐富很多，可能是吸引更多傳粉昆蟲的原因之一。而且不論是油菜花還是梨花，大多數氣味物質都是由花藥提供，說明花藥是花朵氣味的主要來源。

本研究表明，油菜花中含量及比例較高的揮發性化合物是氧烷類、酯類及苯丙腈，氣味貢獻物主要來自于反-2-己烯醛、異硫氰酸-2-苯乙酯、4-異硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚等化合物；梨花中含量及比例較高的是氧烷類、乙醇、苯甲醛，氣味貢獻物主要來自于二甲基硫醚、十四甲基環七硅氧烷、苯丙腈、苯甲醛等化合物。有研究表明，苯乙醛對鱗翅目昆蟲具有引誘性[26]，苯甲醛是一種廣泛存在于蜜源植物中的揮發性化合物，但其對金斑蝶的吸引力要顯著弱于桉樹腦、α-蒎烯等化合物[27]，芳香族化合物可以吸引傳粉昆蟲[10]，說明揮發性化合物在吸引傳粉昆蟲中發揮了重要作用。但各種氣味成分相互作用是一個較為復雜的過程，而且氣味物質成分與溫度、濕度、光照、水肥管理、栽培條件以及品種等多種因素有關，因此李中珊[28]所測梨花氣味物質與本研究差異較大。

梨花是異花授粉作物，但訪花昆蟲數量較油菜花極少。梨花和油菜花氣味物質中含有5種共有物質，梨花中另有4種氣味物質是油菜花中未檢測到的，梨花中的這4種氣味物質是否對傳粉昆蟲具有趨避作用，還是由于相較于油菜，梨花花蜜分泌較少，從而導致梨花傳粉昆蟲數量少，這些仍然需要后續開展深入的研究進一步驗證。

傳粉昆蟲通過嗅覺感知蜜粉源植物的存在并進行采集，這對于異花授粉作物的結實至關重要。本研究比較了梨和油菜花的揮發性氣味物質并分析了2種作物揮發性氣味物質的差異，研究結果可為解決梨樹授粉中存在的難以吸引傳粉昆蟲的問題，找出對昆蟲有吸引力的氣味物質，進而通過噴施化學物質來達到吸引更多昆蟲的目的提供一定的研究思路。