超干處理延長菜豆種子壽命的生理生化機制研究

孫 璐，馮國軍，劉大軍，楊曉旭，劉 暢，閆志山

（黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

菜豆味道鮮美且營養價值高，富含蛋白質、膳食纖維、鎂等元素。菜豆種子在一般條件下不耐貯藏，菜豆種子的老化和活力喪失對其種質資源保存和現實生產會造成巨大損失。長期保存種子需要貯藏溫度、種子含水量2個關鍵控制因素。國際植物遺傳資源委員會(BIPGR)把(5±1)%含水量、-18℃低溫作為種子儲藏保存的理想條件，目前常采用低溫和超低溫的方式來貯藏種質，但冷庫的建設和運行成本昂貴，耗資巨大。種子超干貯藏(ultra-dry storage)是將種子水分降至5%以下（一般認為5%是種子安全含水量下限），密封后在室溫下貯藏種子的技術和方法[1]，讓種子含水量與儲存溫度兩者之間有某種意義上的互補關系。研究表明，低含水量狀態下的種子劣變程度降低，且在一定的含水量范圍內，降低種子含水量得到延長種子壽命的效果與低溫儲存種子一樣[2]。不同品種的種子耐干的特殊性質差異很大，對大蔥[3]、芝麻[4]、落葉松[5]、黃花補血草[6]、花生[7]等植物種子超干的研究結果表明，大部分作物種子的超干處理可以減緩種子老化，種子的活力可以在長期內保持較高水準，且對種子無害。油料種子可忍受極高程度的脫水，且對活力沒有影響；蛋白質類的種子以及淀粉類的種子品種間耐干能力上存在很大的差異性，如大豆、大麥和水稻[8-10]。當含水量低于某一臨界點時，種子壽命縮短，甚至出現干燥受損、活力下降的現象[11]。超干貯藏技術想要得到廣泛的應用，主要是確定不同品種種子超干的下限含水量。種子活力的喪失通常歸因于原生質膜完整性的喪失，盡管目前尚不清楚膜損傷是種子變質的主要原因還是次要效應，但仍可以將其視為種子老化的早期癥狀。人工高溫高濕加速老化種子經常用來測定種子活力。人工老化是人為控制種子在短時間內進行劣變老化，控制種子的活力、發芽率、發芽勢等快速下降，人工老化可以模擬自然界中種子老化的過程。

本研究以菜豆種子為材料，對它們進行超干和人工老化處理，從發芽率、熱穩蛋白含量、丙二醛(MDA)含量等方面對菜豆種子超干貯藏的效果進行研究，探討菜豆種子超干貯藏的可行性，以利于菜豆種質資源的保存。

1 材料與方法

1.1 材料

由黑龍江大學園藝學團隊收集和保存的菜豆種質資源篩選出‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’，初始含水量分別為12.44%、12.77%、11.87%，初始發芽率分別為98.67%、87.33%、89.33%。

1.2 種子超干處理及老化

在室溫條件下利用硅膠干燥[12]，將種子裝入尼龍網袋，置于裝滿硅膠的干燥器中，硅膠與種子的質量比為10:1，制備不同含水量的種子。置于40℃、90%濕度恒溫箱中保溫老化6天[13]。

1.3 回濕處理

對老化后的種子采取逐級回水處理[14]。將不同含水量的種子放入裝有飽和CaCl2溶液、飽和NH4Cl溶液及水的干燥器中，密封，各平衡24 h，使種子含水量逐步提高。

1.4 種子發芽率、活力以及硬實率的測定

回水處理后的菜豆采用《國際種子檢驗規程》標準測定種子發芽率、發芽指數和活力指數[15]，種子萌發溫度為20℃/25℃(12 h/12 h)，7天統計結束，每次測定50粒種子，3次重復。活力指數(VI)按式(1)～(2)計算。同時對種子的硬實率進行測定[16]。

式中，GI為發芽指數，Gt為t日后發芽數，Dt為發芽時間，Sx為發芽x天后小苗的平均胚軸長。

1.5 生理指標測定

參照張憲政[17]的方法，稱取0.2 g種子，置于裝有50 mL蒸餾水的燒杯中，用DDS-IIA型電導率儀測定此時的電導率(A)，然后將加有蒸餾水的種子于25℃恒溫條件下浸泡24 h后，用DDS-IIA型電導率儀測定此時的電導率(B)，再將其置于沸水鍋中水浴30 min，待冷卻到室溫后測定電導率(C)。

稱取吸脹24 h的種子0.5 g，種子可溶性蛋白含量采用李合生的考馬斯亮藍G-250染色法[18]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[19]，超氧陰離子自由基(O2-)產生速率采用比色法[20]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度計法測定，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法[21]。

1.6 胚根細胞線粒體超微結構觀察

隨機選取含水量范圍為12%、8.5%、6.5%和5.5%的種子樣品，浸泡12 h，取種子的胚根，固定在4%戊二醛溶液中7天，放置在4℃保存。然后酒精梯度脫水，再利用四氧化鋨固定，最后用樹脂包埋。利用LKB8800 III超薄超微切片機切片，再用透視電鏡觀察切片[22]。

1.7 數據處理

各數據3次重復取平均值，用SPSS 25.0軟件在P=0.05下利用LSD多重比較進行數據分析，用Excel 2016軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 菜豆種子的干燥過程

在室溫條件下利用硅膠干燥法，‘將軍’含水量由12.44%降至8.52%、6.95%、5.78%分別需要6、15、105天，‘紫冠’含水量由12.77%降至8.38%、6.89%、5.35%分別需要6、15、105天，‘熱那亞’含水量由11.87%降至6.04%、5.95%、5.01%分別需要6、15、105天（圖1）。3種菜豆種子干燥速率均呈先快后慢的變化趨勢，且整體干燥進程中，‘熱那亞’的干燥速度快于‘將軍’和‘紫冠’，前者含水量的降低速率比后者快0.3%～2%。這可能與種子大小以及所含物質成分有關。

圖1 菜豆種子在室溫下的脫水速率

2.2 超干處理對菜豆種子活力的影響

隨著含水量的降低，‘將軍’和‘紫冠’種子均出現硬實現象，而‘熱那亞’沒有出現硬實。種子硬實是因種皮結構過于緊密從而導致種子吸脹能力差，這是一種讓種子處于休眠狀態的保護機制，菜豆種子硬實現象普遍存在，在打破種子硬實后，種子依舊可以發芽。與未超干種子相比，超干處理的3個品種菜豆種子發芽率均顯著上升。當‘將軍’種子由初始含水量12.44%降到5.78%時，‘將軍’種子的硬實率上升至16.00%，發芽率上升了22個百分點；當‘紫冠’種子由初始含水量12.77%降到5.35%時，硬實率上升至6.77%，發芽率上升了27個百分點；當‘熱那亞’種子由初始含水量11.87%降到5.01%時，發芽率上升了46個百分點（表1）。在菜豆種子老化過程中，適度的超干處理使菜豆種子的發芽率上升，但不同品種間存在差異。

表1 老化處理后超干菜豆種子萌發和活力水平

2.3 超干處理對菜豆種子胚胎線粒體細胞的影響

菜豆種子中線粒體的顯微鏡觀察表明，在種子衰老過程中，胚胎細胞中的線粒體超微結構受到破壞，與種子水分含量有關（圖2）。在含水量為5.78%的‘將軍’種子中，胚胎細胞中的線粒體保持完好，清晰可見雙層膜和線粒體嵴，而12.44%老化的‘將軍’種子中看不到膜，且細胞呈解體狀態（圖2A～B）。在含水量為5.01%的‘熱那亞’種子中，線粒體膜在種子中是正常的，線粒體內膜和嵴清晰可見。在含水量為11.87%的‘熱那亞’種子中，種子中線粒體內膜和線粒體嵴消失，線粒體開始呈液泡狀結構并分解（圖2C～D）。在含水量為5.35%的老化‘紫冠’種子中，胚胎細胞中的線粒體保持完好，清晰可見雙層膜，12.77%老化的‘紫冠’種子中看不到膜，且細胞呈解體狀態（圖2E～F）。說明超干處理有利于種子在老化過程中線粒體的保持。

圖2 不同含水量菜豆種子老化胚根線粒體結構變化

2.4 超干老化處理對菜豆種子生物膜透性的影響

經過人工老化處理后，超干處理的‘將軍’、‘熱那亞’種子的電解質滲透率隨著含水量的下降而降低，而‘紫冠’種子的電解質滲透率在各含水量之間不存在顯著差異（圖3）。說明在不同的菜豆品種中，超干處理對電解質滲透率的影響不同，且適度的超干處理有利于維持生物膜的完整性。

圖3 不同含水量菜豆種子老化后電導率變化

經過人工老化處理后，超干處理的‘將軍’種子熱穩蛋白含量都顯著高于對照，在含水量為6.95%時達到最高值；‘紫冠’和‘熱那亞’種子的熱穩蛋白含量呈上升趨勢，且差異明顯，在含水量在6%左右時均顯著高于對照（圖4）。這說明在菜豆種子老化過程中，超干處理阻止蛋白在老化過程中的變性，增加種子的抗老化能力。

圖4 不同含水量菜豆種子老化后熱穩蛋白含量變化

經過老化處理后，超干處理的3種菜豆品種種子的MDA含量顯著低于未經超干的菜豆種子（圖5）。未經超干的菜豆種子MDA含量最高，其中‘紫冠’變化最明顯，未超干的‘紫冠’種子MDA含量約是含水量為5.35%種子的1.84倍。說明適度超干處理保持種子的活力，種子耐藏性得到很大改善。

圖5 不同含水量菜豆種子老化后MDA含量變化

在人工加速老化過程中，超干處理后‘將軍’和‘熱那亞’種子O2-產生速率隨著含水量的降低而顯著降低，‘紫冠’脫水至6.89%時O2-產生速率呈下降趨勢且顯著低于未超干種子，在5.35%時有所回升，但仍顯著低于對照（圖6），未經超干的3個菜豆品種種子O2-含量約為含水量在5.5%范圍種子O2-含量的2倍。表明超干處理后的菜豆種子抗老化能力更強。

圖6 不同含水量菜豆種子老化后O2-含量變化

2.5 超干處理對菜豆種子自由基清除系統的影響

在人工加速老化過程中，與未經超干處理的種子相比，超干處理后的3個菜豆品種種子的SOD活性顯著增高，說明適度超干處理可以提高菜豆種子SOD活性水平（圖7）。

圖7 不同含水量菜豆種子老化后SOD含量變化

在人工加速老化過程中，種子POD酶活性與未超干種子相比有不同程度的上升，且不同含水量間POD酶活性差異顯著。3個品種POD酶活性在初始含水量時最低，‘將軍’種子在含水量為6.95%活性最高，‘紫冠’和‘熱那亞’品種種子在含水量分別為5.35%和5.01%時最高（圖8）。由此可見，適度超干可以提高種子的POD活性。

圖8 不同含水量菜豆種子老化后POD含量變化

在人工加速老化過程中，與未超干種子相比，超干處理的‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’種子的CAT活性明顯增高（圖9），‘將軍’和‘熱那亞’種子在含水量分別為6.95%和6.15%時最高，‘紫冠’種子含水量在5.35%活性最高，約是CK的1.74倍，變化明顯。說明超干處理可以使菜豆種子的CAT活性顯著增高。

圖9 不同含水量菜豆種子老化后CAT含量變化

3 結論與討論

菜豆種子為蛋白質類種子，籽粒大，親水性強，且隨著含水量下降，‘將軍’和‘紫冠’種子出現了硬實現象。菜豆種子脫水速度較慢，‘將軍’種子經過101天干燥含水量降至5.78%左右，‘紫冠’種子經過110天含水量降至5.35%左右，‘熱那亞’種子經過62天干燥至含水量5%。油脂類種子的含水量安全下限比較低（一般在1%～2%），淀粉類種子的含水量安全下限一般在4%～5%[23]，而蛋白質類種子的含水量安全下限一般在3%左右，也有蛋白質較高的豌豆、綠豆、豇豆的最適含水量為6%[24]。本研究表明，‘將軍’種子含水量在5.78%～6.95%時、‘紫冠’種子含水量在5.35%～6.89%時、‘熱那亞’種子含水量在5.01%～6.15%時，種子老化后的各項發芽和生理指標優于自然含水量種子，可以利用室溫硅膠干燥法獲得‘將軍’、‘紫冠’、‘熱那亞’超干種子，這與其他高蛋白質類種子較接近。

熱穩定蛋白積累與種子耐脫水性的獲得相關[25]。朱誠[26]對超干大豆、花生種子研究中，發現超干可以提高蛋白質的熱穩定性。究其原因是菜豆種子內部的蛋白質構象發生變化，或者與其他物質發生某種反應，阻止蛋白的變性并增加了穩定性。MDA就是脂質過氧化反應最重要的產物之一，也是種子老化的基本原因[27]。本研究中，老化后的超干菜豆種子MDA含量有所積累，但是膜系統完整且含量低于未超干的菜豆種子，這與程紅焱[13]的研究結果相似。這可能是因為隨著含水量的降低，脫水面積增大，缺乏化學反應介質，脂質擁有較強的自衛能力，可以在一定程度上抑制了種子老化過程中有害物質的積累，膜系統完整性得到保持。試驗表明，超干可以提高種子貯藏穩定性，究其原因自由基清除系統SOD、POD、CAT可以清除由自由基引起的脂質過氧化。種子在貯存期間積累的有毒物質會在種子吸漲時被恢復活性的酶清除，減少了對細胞膜的損傷，種子得以萌發[28]。適度超干處理可提高菜豆種子貯藏穩定性。

就目前而言，種子超干最適合的含水量研究還沒有形成完善的體系，有許多問題仍然需要不斷探索。本研究也存在著一些不足，在菜豆種子的超干過程中，采用硅膠干燥的方法雖然安全溫和，但干燥速率緩慢且不容易控制，獲得了包括對照在內共4種含水量。如何快速安全的干燥種子且能精準控制含水量范圍還是一大難題，這也是超干研究發展的方向。在超干研究中，為了加快試驗進度，自然老化種子方法使用較少，基本利用50℃以上高溫人工老化種子，人工老化種子雖然可以在短時間內快速控制種子的劣變，但一定程度上并不能完全代替自然老化。2種方法對于超干種子具體的影響，還有待進一步深入研究。

綜上所述，‘將軍’種子含水量為5.78%～6.95%時儲藏較為適宜，‘紫冠’種子含水量為5.35%～6.89%時儲藏較為適宜，‘熱那亞’種子以含水量5.01%～6.15%時儲藏較為適宜，采用超干保存技術保存菜豆種子具有一定的可行性。