知母-黃柏配伍抗炎作用機制的網絡藥理學研究

潘會君，朱全剛，朱聰聰

(1.上海市皮膚病醫院，上海 200443；2.同濟大學附屬皮膚病醫院，上海 200443)

知母-黃柏配伍是臨床上常用的藥對，廣泛用于實熱證和虛熱證的治療，如知柏地黃丸、滋腎通關丸等經典方均含有知母-黃柏藥對。已有的研究顯示，知母-黃柏藥對鹽炙前后對糖皮質激素致腎陰虛大鼠具有滋陰清熱作用[1]；知母提取物及黃柏提取物具有降糖作用，對糖尿病模型小鼠的周圍神經病變有保護作用[2]；能提升胰島素敏感性，促進糖脂代謝[3]。知母-黃柏藥對可能通過調節PI3K/Akt通路而實現對Ⅱ型糖尿病大鼠認知功能障礙的改善[4]。

隨著高通量組學、生物信息學、計算機科學等多種學科的交叉，國內外學者開始將視角轉向復雜網絡，網絡藥理學應運而生[5]。越來越多的中藥配伍研究采用網絡藥理學進行分子機制、作用靶點、毒性研究等。通過網絡藥理學分析，知母-黃柏藥對影響糖尿病胰島素抵抗、胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、炎癥通路和Ⅰ、Ⅱ型糖尿病通路[6]，并對精神分裂癥、糖尿病、 阿爾茨海默癥、非特異性癌癥、哮喘、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肥胖、心血管疾病等具有潛在的作用[7]。

炎癥是機體防御感染及修復損傷的保護性反應，在機體自穩中發揮著重要的調節作用，過度的炎癥反應會對機體造成損害，引起器官的組織和細胞發生變性壞死，并且有可造成嚴重后果[8]。因此，抗炎藥物對于解決炎癥性疾病具有重要作用。臨床上非甾體類抗炎藥是臨床使用最廣泛的消炎、鎮痛藥物之一，近年來生物制劑(TNF-α 拮抗劑、IL-17 拮抗劑、IL-12 /23 拮抗劑、IL-23 拮抗劑)也廣泛用于炎癥性疾病的治療，如腫瘤、關節炎、銀屑病、特應性皮炎等。

已有的研究顯示，知母-黃柏藥對具有抗炎作用，其抗炎作用與NF-κB信號通路相關[9]。知母-黃柏藥對屬于中藥“相須”配伍，其相須配伍的抗炎作用機制尚未闡釋清楚。因此，本研究采用網絡藥理學方法對知母-黃柏“相須”配伍的協同抗炎作用進行解析，從而豐富知母-黃柏藥對的協同抗炎作用，為其治療炎癥性疾病提供依據。

1 方法

1.1 成分收集、篩選及靶點預測

從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取化學成分，根據口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.1進行篩選[10]。從中醫藥百科全書數據庫(an encyclopedia of traditional chinese medicine ，ETCM)(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)收集知母和黃柏的化學成分，根據藥物相似程度權重值(druglikeness weight，DW)≥0.49篩選化學成分[11]。通過ETCM、TCMSP收集的所有靶點進行合并去重，統一在UniProt上校正，轉換成homo sapiens的Official Gene Symbol。

1.2 炎癥相關靶點的獲取

通過 OMIM(online mendelian inheritance in man)數據庫(https://omim.org/)[12], Phenopedia數據庫 (https:// phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)[13]，以“inflammation”為關鍵詞進行捜索，收集靶點，去除重復，獲得炎癥相關靶點。

1.3 篩選知母-黃柏藥對抗炎靶點

通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[14]將篩選得到的中藥靶點映射到炎癥靶點，得到知母-黃柏藥對的潛在抗炎靶點。

1.4 知母-黃柏藥對抗炎靶點網絡的構建

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建知母和黃柏中藥-成分-靶點網絡，并使用Network Analyzer插件分析網絡節點的拓撲性質參數，確定靶點的受調控分[15]，從而確定靶點被中藥調控的強度。網絡節點的拓撲性質參數，包括度(degree)、介數中心度(betweenness)及接近中心性(closeness)[16]。研究認為，一個點的度值為該網絡度中位數的2倍或以上則定義為核心成分和靶點[17]。

1.5 GO及KEGG富集分析

利用DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[18]在線分析工具對知母-黃柏藥對的潛在抗炎靶點進行基因本體(gene ontology,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集。使用OmicStudio tools(https:// www.omicstudio.cn/tool)對富集結果進行氣泡圖繪制。

1.6 中藥-成分-抗炎靶點-信號通路的網絡構建及分析

使用OmicStudio tools繪制中藥-成分-抗炎靶點-信號通路桑基圖。

2 結果

2.1 知母-黃柏藥對的成分及靶點

通過 TCMSP和ETCM 數據庫共獲得知母化學成分25個，黃柏化學成分42個，知母、黃柏共有成分1個，為Stigmasterol(圖1)；知母化學成分對應靶點141個，黃柏化學成分對應靶點250個，知母、黃柏共有靶點113個(圖1)。知母、黃柏共有成分、共有靶點從一定程度上為知母-黃柏的“相須”配伍提供了物質基礎及分子基礎。

圖1 知母-黃柏藥對化學成分及靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

通過構建知母-黃柏-成分-靶點網絡(圖2)，發現存在單一成分作用在多個靶點的現象，同一靶點與多種成分相關,符合中藥多成分、多靶點相互作用的特征，知母-黃柏多種成分參與對共有靶點調控，為其“相須”配伍提供了分子靶點基礎。

圖2 知母-黃柏藥對化學成分-靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.2 炎癥靶點庫的構建

通過OMIM,Phenopedia數據庫，以“inflammation”為關鍵詞進行檢索，收集靶點，去除重復，獲得炎癥相關靶點2597個(圖3)。

2.3 知母-黃柏藥對對炎癥靶點的調控作用

為研究知母-黃柏藥對靶點與炎癥靶點的關系，本研究將知母靶點、黃柏靶點映射到炎癥靶點，結果發現，91個知母靶點與炎癥靶點重疊，168個黃柏靶點與炎癥靶點重疊，182個知母-黃柏藥對靶點與炎癥靶點重疊，這些靶點定義為潛在抗炎靶點。其中77個靶點為知母、黃柏、炎癥共有(圖3)，共有靶點為知母-黃柏藥對“相須”抗炎作用提供了直接作用分子靶點。

圖3 知母-黃柏靶點與炎癥靶點的維恩圖Fig.3 Venn diagram of the targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex and inflammation

為了評價靶點被中藥調控的強度，引入靶點的受調控分進行評價。靶點的受調控分為靶向此蛋白的中藥-化合物組合的數量，例如，只有一個化合物靶向某靶點，但是此化合物包含在復方的3 味中藥中，此靶點的受調控分為3；另一個靶點被2個化合物所靶向，其中一個化合物包含在2味中藥中，另一個包含在另外3味中藥中，這個靶點的受調控分就是5。受調控分高的靶點即為受復方作用更強的靶點。

通過分析知母-黃柏藥對與炎癥的潛在作用靶點網絡圖(圖4)，發現其中不少靶點都具有較高的受調控分，其中知母靶點受調控分中位數為1，黃柏靶點受調控分中位數為2，知母-黃柏藥對靶點受調控分中位數為4，知母-黃柏配伍后靶點受調控分明顯增加，說明“相須”配伍具有分子靶點協同作用。知母-黃柏配伍后靶點受調控分≥8的靶點為29個，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等(表1)。

圖4 中藥-成分-靶點網絡圖Fig.4 Network diagram of TCM-constituents-targets

表1 靶點受調控得分

2.4 GO富集分析

對182個潛在抗炎靶點進行GO分析，根據P<0.01且錯誤發現率FDR(false discovery rate)<0.01得到GO條目301條。GO 富集分析分為3 類：生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。將GO條目按FDR從小到大排序后選取前20繪制BP、CC和MF的柱狀圖(圖5)。

圖5 知母-黃柏藥對潛在抗炎靶點參與的生物過程、細胞組分、分子功能Fig.5 Biological process, cell component, and molecular function of potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

BP相關的條目最多，有235條，主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的調控、藥物反應、細胞增殖的正向調節、細胞凋亡的正向調節、一氧化氮生物合成的正向調節、細胞缺氧反應、細胞對脂多糖的反應、平滑肌細胞增殖的正向調節、炎癥反應、ERK1和ERK2級聯的正向調節、蛋白激酶B信號通路的正向調節、細胞遷移的正向調節、腫瘤壞死細胞因子反應等方面；CC相關的條目25條，主要涉及細胞質膜、胞質溶膠、內質網、核染色質、外泌體和線粒體等方面;MF相關的條目38 條，主要涉及蛋白結合、酶結合、轉錄因子結合、蛋白激酶結合、絲氨酸型內肽酶活性、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、RNA聚合酶 Ⅱ 轉錄因子活性和血紅素結合等方面。

2.5 KEGG 通路富集

對182個潛在抗炎靶點進行KEGG 通路富集，根據P<0.01得到106條KEGG通路，與癌癥、炎癥、慢性疾病、感染等相關。涉及癌癥，如癌癥通路、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、癌癥中的蛋白多糖、非小細胞肺癌、膠質瘤、慢性粒細胞白血病；信號轉導，如TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXO信號通路、VEGF信號通路；免疫系統，T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路；內分泌代謝性疾病，如胰島素抵抗、 催乳激素信號通路等；病毒感染疾病，如乙型肝炎，甲型流感，丙型肝炎；信號分子及其相互作用，如神經活性配體-受體相互作用；細菌感染疾病，如查加斯病；寄生蟲感染疾病，如弓形蟲病；以及破骨細胞分化等。以上KEGG通路均與炎癥密切相關，因此知母-黃柏藥對調節炎癥信號通路，發揮治療炎癥相關性疾病的作用。將KEGG通路按P<0.01 從小到大進行排序后選取排名前60的通路繪制氣泡圖(圖6)。

圖6 知母-黃柏藥對潛在作用靶點富集的KEGG 通路Fig.6 KEGG pathway of the potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.6 知母-黃柏藥對協同調控炎癥信號通路

已有的研究顯示，炎癥與信號轉導通路密切相關，為了更直接地理解知母-黃柏配伍對信號通路的協同作用，構建知母-黃柏藥對中藥-成分-靶點-通路桑基圖(圖7)。從圖7中發現，知母-黃柏藥對所含成分，靶點作用于多條信號轉導通路，如TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXO信號通路、VEGF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路；并且每條信號通路均有知母和黃柏相應的成分和靶點參與，兩藥協同調控炎癥信號轉導通路發揮抗炎的作用。知母和黃柏共同調節炎癥相關分子靶點，如磷酸肌醇3激酶(PIK3CG)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2) 、內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1)、毒蕈堿型膽堿受體M2(CNRM2)、類視黃醇X受體 alpha (RXRA)、轉錄因子AP-1 (JUN)、轉錄因子p65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)等。因此，知母-黃柏藥對“相須”作用的分子機制是通過多成分、多靶點調控共同信號通路發揮抗炎作用。

圖7 知母-黃柏藥對中藥-成分-靶點-通路桑基圖Fig.7 Sankey diagram of TCM-constituents-targets-pathways of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法對知母-黃柏藥對的抗炎作用進行解析，結果發現182個知母-黃柏藥對靶點與炎癥靶點重疊，知母-黃柏配伍后靶點受調控分大于等于8的靶點為29個，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等；知母-黃柏藥對所含成分，靶點作用于多條信號轉導通路，如TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXO信號通路、VEGF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路等。體外細胞研究顯示，知母-黃柏30%醇洗脫部位能明顯降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及降低NO分泌，并降低iNOS和COX-2蛋白及基因表達，抑制NF-κB信號通路[9]。通過網絡藥理學發現，知母-黃柏藥對可以調控NF-κB信號通路，影響PTGS2(即COX-2)表達，影響NO合成，以及TNF分泌，文獻報道的實驗結果與預測相吻合。在KEGG通路及生物過程分析時發現，知母-黃柏藥對能影響胰島素抵抗，因此其對糖尿病可能具有潛在的作用。已有的實驗研究也證實知母-黃柏藥對對糖尿病動物模型有明顯的改善作用，能減輕對胰島素的抵抗[2-3]，與預測相吻合。

炎癥在腫瘤發生過程中具有重要作用，對炎癥的調控成為腫瘤研究的熱點。KEGG通路及生物過程分析發現，知母-黃柏藥對對多種腫瘤具有潛在作用。研究顯示，知母藥材不同藥用部位對人胃癌HGC-27細胞、人肝Hepg-2細胞和人結腸癌Caco-2細胞體外增值具抑制作用，并能抑制LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO[19]；黃柏的成分黃柏苷可以通過阻滯細胞周期，上調Bax因子的表達，同時下調Bcl-2因子的表達，并且激活caspase 3進而誘導A549細胞凋亡[20]。因此，基于已有的實驗證據，知母-黃柏藥對可以用于腫瘤治療，臨床腫瘤的中醫治療往往在中藥復方基礎上配伍知母-黃柏，其抗腫瘤作用可能與炎癥密切相關。

總之，本研究運用網絡藥理學方法揭示了知母-黃柏藥對的抗炎作用機制。知母-黃柏藥對通過多種成分、多靶點共同調控炎癥信號通路及炎癥疾病通路，影響炎癥生物學過程，發揮抗炎作用，從而治療疾病。本研究為知母-黃柏藥對“相須”配伍提供了分子依據，基于網絡藥理學研究深入挖掘知母-黃柏藥對的分子機制將有利于其在臨床上的精準使用。