菝葜多糖分離純化工藝研究

梅明，周進，張毅，馬良鵬，楊明，胡松*

(1.武漢市第一醫院 藥學部，湖北 武漢 430030；2.江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

菝葜為百合科植物菝葜的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風除痹與解毒散瘀的功效[1-2]，始載于《名醫別錄》，現收載于《中國藥典》2015版一部[3]。實驗研究表明，菝葜有效成分為皂苷、黃酮、有機酸及多糖等，其總提取物有鎮痛、抗炎、抗感染、降血糖及增強機體免疫力等作用，臨床上廣泛用于婦科慢性疾病的治療，如慢性盆腔炎、附件炎等[4]。目前關于菝葜有效成分的研究主要集中在皂苷類與黃酮類成分，然而近年來多糖類成分越來越被人們所重視，且有報道表明菝葜多糖具有明顯的免疫調節等作用[5-6]，這為開展菝葜多糖類成分的研究提供了依據。本文對菝葜多糖進行了醇沉工藝與大孔吸附樹脂純化工藝研究，為其進一步開發利用提供了依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

FA1104型萬分之一電子天平(上海天平儀器廠)；Mettler AE240型十萬分之一電子天平(德國Mettler公司)；UV-1700型紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)； KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ93型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；DZF6020型減壓干燥箱(上海喬躍電子有限公司)。

1.2 實驗材料

無水葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110833-201205，純度≥99%)；菝葜(批號121028)購于四川新荷花飲片有限公司，由成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為百合科植物菝葜的干燥根莖；HPD-100型、D101型大孔吸附樹脂(成都市科龍化工試劑廠，批號分別為20130305、20120305)，AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學化工廠，批號030605)；甲醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 菝葜多糖的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取已在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10.3 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加純水定容，制成含無水葡萄糖0.103 mg/ mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱取菝葜藥材適量，加入10倍量的體積分數80%乙醇，水浴回流3次，每次1.5 h，濾過，殘渣在水浴上揮干，然后加12倍量的純水，提取3次，每次提取2 h，提取溫度為80 ℃，定容，即得提取液，備用。

2.1.3 線性關系考察

以空白溶劑為隨行對照，精密量取2.1.1項下對照品溶液適量，在波長200～700 nm范圍內進行掃描，發現在490 nm處有特征吸收峰，確定檢測波長為490 nm。分別精密吸取0.50、0.60、0.70、0.80、0.90與1.00 mL對照品溶液，分別置于10 mL具塞試管中，精密加水分別補至2.00 mL，各加入質量分數為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸7 mL，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，冰浴5 min，迅速冷卻至室溫，以相應的試劑作為空白，在490 nm波長處測定，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。計算回歸方程，回歸方程為：y=14.89x-0.029(r=0.999)，結果表明，無水葡萄糖在0.026～0.052 mg/mL范圍內樣品質量濃度與吸光度線性關系良好。

2.2 醇沉工藝研究

2.2.1 醇沉靜置溫度考察

取菝葜多糖水提液適量，減壓濃縮至每毫升水提液含生藥1.0 g，備用。量取3份濃縮液，加入乙醇，使乙醇體積分數達到80%，分別于25、8與2 ℃ 條件下，靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計算多糖出膏率并測定多糖純度[7-9]，結果見表1。

表1 靜置溫度考察

結果表明，25、8和2 ℃靜置效果沒有較大差異，故采用室溫25 ℃靜置醇沉即可。

2.2.2 醇沉靜置時間考察

精密量取4份濃縮液，各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分數達到80%，于室溫25 ℃條件下，分別靜置6、12、24與48 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計算多糖出膏率并測定多糖純度，結果見表2。

表2 靜置時間考察

結果表明，隨著靜置時間的延長，多糖純度與多糖出膏率逐漸增加，靜置12 h即可達到較理想效果，結合工業擴大生產實際考慮，確定醇沉靜置時間為12 h。

2.2.3 藥液質量濃度考察

取4份菝葜多糖水提液，分別稀釋或濃縮至每毫升水提液含生藥0.5、0.8、1.0、1.2 g的藥液，加入乙醇，使乙醇體積分數達到80%，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計算多糖出膏率并測定多糖純度，結果見表3。

表3 提取液生藥質量濃度考察

結果表明，當生藥質量濃度為1.0 g/mL時，醇沉效果較好。

2.2.4 乙醇體積分數考察

精密量取4份濃縮液各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分數分別達到60%、70%、80%、90%，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計算多糖出膏率并測定多糖純度，結果見表4。

表4 乙醇體積分數考察

結果表明，乙醇體積分數為80%時，多糖純度與多糖出膏率均較為理想，因此，確定菝葜多糖的乙醇體積分數為80%。

2.2.5 醇沉次數考察

精密量取3份濃縮液各50 mL，加入乙醇，使乙醇體積分數分別達到80%，分別醇沉1、2、3次，室溫靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，分別得多糖粗品，計算多糖出膏率并測定多糖純度，結果見表5。

表5 醇沉次數考察

結果表明，隨著醇沉次數的增加，多糖純度略有升高，但多糖出膏率呈下降趨勢，綜合考慮多糖純度、多糖得率等，確定最佳醇沉次數為1次。

2.2.6 驗證實驗

綜合前述實驗考察結果，確定最佳醇沉工藝為將提取液濃縮至每毫升含生藥1.0 g，加入乙醇，使乙醇體積分數達到80%，醇沉1次，室溫25 ℃靜置12 h，抽濾得醇沉物，70 ℃干燥，即得，3次驗證實驗結果見表6。

表6 驗證實驗結果

結果表明，多糖醇沉后平均純度為51.77%，平均出膏率為2.12%，結果較為穩定，說明該醇沉工藝穩定可行。

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝研究

2.3.1 大孔吸附樹脂預處理

2.3.2 大孔吸附樹脂靜態吸附與解吸考察

準確稱取已被預處理過的AB-8型、HPD100型、D101型大孔吸附樹脂各2 g，置錐形瓶中，分別加入2.0 mg/mL的菝葜粗多糖溶液50 mL，于20 ℃恒溫條件下，置磁力攪拌器上充分攪拌24 h，充分吸附后，測定殘液中多糖質量濃度，并計算吸附量與吸附率。再將上述經過靜態吸附的大孔吸附樹脂，置于具塞的錐形瓶中，各加入50 mL蒸餾水，20 ℃恒溫條件下，置磁力攪拌器上充分攪拌24 h，過濾，測定解吸殘液中多糖質量濃度，并計算解吸率。計算公式如下：吸附率=(C0-C1)/C0×100%，解吸率=C2V2/(C0-C1)V1×100%，式中，C0為吸附液初始質量濃度，C1為吸附后質量濃度，C2為解吸殘液質量濃度，V1為加入粗多糖溶液體積，V2為加入蒸餾水體積，結果見表7。

表7 大孔吸附樹脂靜態吸附率及解吸率結果

結果表明，相比HPD100型與D101型大孔吸附樹脂，AB-8型對菝葜多糖的吸附率與解吸率均較高，故選擇AB-8型對菝葜多糖進行純化。

2.3.3 上樣液質量濃度考察

準確稱取3份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱，配制1.0、2.0與4.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以2 BV/h的流速用純水進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度并計算吸附率，結果表明上樣液質量濃度為2.0 mg/mL時，多糖吸附率較大，因此確定上樣質量濃度為2.0 mg/mL，見圖1。

圖1 上樣質量濃度考察結果Fig.1 Investigation result of sample concentration

2.3.4 上樣流速考察

準確稱取5份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液1 BV，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行上樣，以2 BV/h的流速用純水進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度并計算吸附率。結果多糖吸附率分別為65.3%、70.2%、67.1%、61.3%與55.2%，表明過大或過小的上樣流速都不利于多糖吸附，綜合考慮確定以2 BV/h的流速進行上樣。

2.3.5 上樣量考察

準確稱取5份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，以2 BV/h的流速進行上樣，分別上樣1、2、3、4、5 BV，再用純水以2 BV/h的流速進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度并計算吸附率，結果見表8。

表8 上樣量考察結果

結果表明，上樣量為1 BV時，多糖吸附率較大，因此確定上樣量為1 BV。

2.3.6 洗脫溶劑考察

準確稱取5份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，再分別用純水、10%乙醇、15%乙醇、30%乙醇與40%乙醇以2 BV/h的流速進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定吸光度值，結果見表9。

表9 洗脫溶劑考察結果

結果表明，隨著乙醇體積分數的增加，洗脫效率反而降低，因此，確定洗脫溶劑為純水。

2.3.7 洗脫速率考察

準確稱取5份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，再分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速，用純水進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度并計算解吸率，結果表明洗脫速率對多糖解吸率有一定影響，當洗脫速率為3 BV/h時，解吸率大，因此，確定洗脫速率為3 BV/h，見圖2。

圖2 洗脫速率考察結果Fig.2 Investigation result of elution rate

2.3.8 洗脫溶劑用量考察

準確稱取5份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以3 BV/h的流速用純水進行洗脫，每1 BV收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度并計算解吸率，結果表明洗脫劑用量為3 BV時，多糖已能充分洗脫，因此綜合考慮時間等因素，確定洗脫劑用量為3 BV，見圖3。

圖3 洗脫溶劑用量考察結果Fig.3 Investigation result of elution amount

2.3.9 驗證實驗

準確稱取3份已被預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂，柱體積為30 mL，濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計)的上樣液，按2 BV/h的流速，上樣1 BV，以3 BV/h的流速用3 BV的純水進行洗脫，收集洗脫液并定容，按擬定方法測定洗脫液中多糖質量濃度。再精密吸取一定體積的洗脫液置恒重后的蒸發皿中，減壓濃縮至一定體積，70 ℃干燥，在干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱重，計算多糖純度，結果見表10。

表10 驗證實驗結果

結果表明，大孔吸附樹脂純化后，多糖平均純度為60.48%，平均得率為1.03%，工藝穩定可行，可用于菝葜多糖的分離純化。

3 討論與結論

大孔吸附樹脂分離技術能從中藥及其復方提取液中通過物理吸附有選擇性地吸附有效成分，從而對中藥中有效部位或有效成分實現分離、純化和富集[17-18]。多糖作為菝葜中的主要活性成分之一，對其分離純化工藝的研究具有一定的現實意義。本實驗通過對菝葜多糖醇沉工藝與大孔吸附樹脂純化工藝的研究，確定了菝葜多糖的最佳純化工藝。通過對醇沉靜置溫度、醇沉靜置時間與藥液質量濃度等因素的考察，優化醇沉工藝，使菝葜多糖的純度達到了51.77%；通過大孔吸樹脂種類、上樣液濃度與洗脫溶劑等因素的考察，優化大孔樹脂純化工藝，將菝葜多糖的純度提高到了60.48%。以上研究使純化后的菝葜多糖符合《藥品注冊管理辦法》[19]中關于中藥注冊申報的相關要求，為菝葜藥材的進一步開發利用奠定了基礎。