番石榴葉中揮發油組分的固相微萃取分析

許亦真

(齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心, 山東 濟南 250014)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一種適應性非常強的熱帶果樹，又稱那拔、番桃樹等，屬桃金娘科[1]。該果樹原產于南美洲，在中國華南地區亦有大面積的人工培植或野生品種。番石榴果實可供鮮食，番石榴葉含有揮發油及結構比較復雜的多元酚類化合物等，可作為中藥使用，有消除痢疾、止血、清熱、健脾胃等功效[2-3]。番石榴葉經煮沸后可去掉單寧等鞣酸組分，將其曬干后，可制作成茶葉，味甘，有清熱之效。大量臨床試驗結果表明[4-8]，番石榴葉具有顯著的降糖降壓、抗氧化、抗菌等功效，同時含有多種維生素以及礦物質元素。其中，傅予等[6]對番石榴葉中總黃酮的提取工藝進行了優化研究，并以小鼠為模型，考察了番石榴葉的降糖特性，驗證了其對維持糖尿病小鼠正常血糖水平的積極效應。

目前，對于番石榴果實中化學組分的研究相對比較全面，但對于葉中化學組分的研究及其作為中藥等的藥代動力學研究相對較少。已有研究證明番石榴葉藥理活性顯著，其中沒食子酸等酚酸類、黃酮類、三萜酸、倍半萜類等物質具有極強的抗氧化和抗炎作用，同時具有一定降糖作用[9-11]。因此，對番石榴葉中揮發油組分的定性分析具有重要意義，可以為其作為中藥的開發利用提供重要的數據支持[12-13]。

Arthur等[14]提出的固相微萃取技術(solid phase microextraction, SPME)，最初主要用于分析環境中的有機污染物，后來經過發展，在食品、藥品等領域得到了廣泛的應用。該技術集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體，操作簡單且高效，富集效果優異。白麗麗等[15]采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術分析了番石榴果實中的揮發性組分，并采用面積歸一化法計算了各組分的相對含量。本研究采用固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術，對番石榴葉中揮發油組分進行分析鑒定，并通過單因素試驗對固相微萃取的條件進行了優化。

1 儀器與材料

Agilent 7890A-5973N氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司)，MS105型微量分析天平(Mettler Toledo儀器公司)，100～1000 μL移液器(編號429358A，德國Eppendorf公司)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HH-420 恒溫水浴鍋(上海一科儀器有限公司)，Millipore超純水系統(美國Merck Millipore公司)，SPME手動進樣手柄、碳分子篩羧乙基/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(CAR /DVB/PDMS)(50 μm)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯PDMS/DVB(65 μm)、聚丙烯酸酯PA(85 μm)、聚二甲基硅氧烷PDMS (100 μm)固相微纖維(美國Superlco公司)。

番石榴葉樣品，2018年采集于云南省玉林市，經過洗滌、晾曬、粉碎并過20目金屬網篩，備用；正己烷、甲醇(色譜純、國藥集團化學試劑有限公司)；氯化鈉(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司)；水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

2 方法與條件

2.1 樣品處理

番石榴葉樣品經過粉碎，過20目金屬網篩，稱取1.0 g待測粉末樣品置于20 mL頂空瓶中，加入5 mL超純水，密封并壓蓋。頂空固相微萃取溫度為70 ℃，時間為40 min，解析時間為5 min。

2.2 氣相色譜分析

目標化合物通過Agilent DB-5 ms(30 m×250 μm,0.5 μm)色譜柱進行分離，升溫程序為：初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/ min升至140 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至280 ℃保持10 min。進樣口溫度280 ℃。采用不分流進樣模式。載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min。

采用NIST 2017數據庫進行化合物的鑒定。離子源為電子電離源(EI)，電離能量為70 eV，溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為300 ℃。掃描模式為全掃描，范圍29～600m/z。

固相微萃取纖維老化與空白試驗：將固相微萃取纖維插入氣相色譜進樣口中老化，進樣口溫度設定為各固相微萃取纖維的最高耐受溫度以下10 ℃，直至沒有雜質峰被檢測出來。取5 mL超純水，加入適當氯化鈉，配置成空白對照溶液，對空白對照溶液進行頂空分析，色譜圖為空白對照譜圖。

2.3 萃取條件優化試驗設計

選取對萃取效果有明顯影響的因素進行單因素試驗，以總出峰數目及總峰面積為因變量，對各因素進行優化。各試驗參數設計如下：(1) 固相微萃取纖維為CAR/DVB/PDMS (50 μm)、PDMS (100 μm)、PDMS/DVB (65 μm)、PA (85 μm)；(2) 萃取溫度 20、35、50、65、80 ℃；(3) 萃取時間 10、20、30、40、50 min；(4) 樣品溶液的離子強度 (氯化鈉的質量分數) 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%。

3 結果與討論

3.1 固相微萃取纖維的選擇

分別對Superlco的4種不同的萃取纖維進行對比，以每種萃取纖維提取出來的目標峰數目為依據，對其萃取能力進行評價分析。其他萃取條件分別為：萃取溫度80 ℃，萃取時間50 min，樣品溶液的離子強度為0。結果見圖1。CAR/DVB/PDMS混合涂層的固相微萃取纖維能夠提取出69種化合物，PDMS/DVB、PDMS分別提取出了60和44種化合物，而PA涂層的固相微萃取纖維僅能夠提取29種化合物。因此，采用CAR/DVB/PDMS固相微萃取纖維對番石榴葉中的揮發油物質進行提取。

圖1 固相微萃取纖維對萃取效率的影響Fig.1 Effects of sorbents of SPME fiber on the extraction efficiency

3.2 萃取溫度的優化

提高萃取溫度有利于植物組織中揮發性組分揮發至頂層空氣中，對萃取過程有積極影響。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取時間50 min，樣品溶液的離子強度為0。通過圖2可以看出，溫度從20～80 ℃的遞增過程中，提取的總化合物個數和總峰面積均在不斷增長。考慮到溫度提升至80 ℃，對萃取效率的提升沒有太多積極影響，反而溫度過高容易導致某些物質產生化學變化。因此，本試驗中以65 ℃作為最優萃取溫度。

圖2 固相微萃取溫度對萃取效率的影響Fig.2 Effects of sorbents of SPME extraction temperature on the extraction efficiency

3.3 萃取時間的優化

由于萃取時間的改變對提取目標物個數的影響沒有對總峰面積的影響大，因此，以總峰個數和總峰面積的變化為依據，選擇最優的萃取時間。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取溫度65 ℃，樣品溶液的離子強度為0。從圖3中可以看出，隨著萃取時間的不斷增長，總峰面積和總峰個數也隨之不斷增加，并在40 min的時候達到最高。故選擇40 min作為最優萃取時間。

圖3 固相微萃取時間對萃取效率的影響Fig.3 Effects of sorbents of SPME extraction time on the extraction efficiency

3.4 離子強度的優化

由于鹽析效應的存在，特定情況下加入一定量的無機鹽能夠促進一些物質從溶液中分離出來或者揮發出來。本試驗采用氯化鈉作為鹽析劑，并以總峰個數和總峰面積的變化為依據來選擇最優的鹽析劑加入量。其他萃取條件分別為：萃取涂層為CAR/DVB/PDMS，萃取溫度65 ℃，萃取時間40 min。從圖4中可以看出，在樣品溶液的離子強度(氯化鈉質量分數)為20%的條件下，結果最優。

圖4 固相微萃取離子強度對萃取效率的影響Fig.4 Effects of sorbents of SPME ionic strength on the extraction efficiency

通過優化試驗得出最優的試驗條件為：CAR/DVB/PDMS萃取纖維；萃取溫度65 ℃；萃取時間40 min；離子強度20%。

3.5 揮發油組分分析

通過GC/MS分析，最多可以分離出70個色譜峰，其中能夠通過美國國家標準與技術研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)譜庫鑒定出化合物結構的有47個，其相對含量占總揮發油組分含量的93.93%。色譜圖以及鑒定出的化合物分別見圖5和表1。

表1 番石榴葉中揮發油組分及含量

續表1

圖5 番石榴葉揮發油組分總離子流圖Fig.5 The total ion chromatogram of volatile compounds in guava leaves

經過NIST譜庫分析，鑒定出的47種化合物中麥芽酚的含量相對較高，占總揮發性及半揮發性組分含量的10.65%。相對含量較高的化合物有二氫獼猴桃內酯(7.69%)、石竹烯(6.06%)、植酮(5.39%)、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮(4.36%)、咕吧烯(4.00%)、芳樟醇(3.42%)、棕櫚酸甲酯(3.14%)、α-紫羅蘭酮(3.08%)以及2-十三碳烯醛(3.06%)。根據化合物基團的不同進行統計，其中酮類化合物有8種，其相對含量最高，占總含量的18.82%；醛類化合物共有14種，占總含量的17.95%；酯類化合物共有5種，占總含量的14.41%；醇類化合物共有6種，占總含量的11.37%；烯烴類化合物共有4種，占總含量的13.43%，酸類化合物共有2種，占總含量的1.58%；剩余酚類等其他化合物共有8種，占總含量的16.41%。

4 結語

本研究通過固相微萃取-氣相色譜質譜法提取了番石榴葉中的揮發油組分，共鑒定出47種有機化合物，占總揮發油組分含量的93.95%。鑒定出的主要組分有麥芽酚、二氫獼猴桃內酯、石竹烯、植酮、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮、咕吧烯、芳樟醇、棕櫚酸甲酯、α-紫羅蘭酮和2-十三碳烯醛，其相對含量均大于3%。鑒定出來的酮類化合物有8種，其相對含量最高，占18.82%；其余依次為醛類 (17.95%)、酯類 (14.41%)、烯烴類(13.43%)、醇類 (11.37%)、酸類 (1.58%)和酚類 (10.65%)。其他類化合物共有8種，占總含量的16.41%。其中，多種化合物具有一定的降糖、降血壓等藥用價值。綜上所述，該方法對番石榴葉中揮發油組分的分析效果良好，可為番石榴葉藥用價值的研究提供方法及數據支持。