HPLC 法測定銀菊止癢洗液中4 種化學成分的含量＊

謝 巍，楊 妮，肖 萍，盧森華，莫禮艷

銀菊止癢洗液由金銀花、野菊花、千里光、白鮮皮、苦參、蛇床子、地膚子七味中藥組成，是筆者醫院在多年臨床經驗的基礎上，辨證施治總結出的有效方劑。具有清熱解毒、燥濕止癢之效，用于小兒濕熱內蘊，腠理失和所致濕疹。其中，金銀花宣散風熱，清解血毒；野菊花疏散風熱，清肝明目，解毒；蛇床子燥濕，祛風，殺蟲的功效［1］；金銀花、野菊花、蛇床子主要化學成分有綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-5］。據相關文獻報道，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有較強的抗真菌、細菌、抗炎、抗病毒、抗心肌纖維化等作用［6-12］，提示其可能為銀菊止癢洗液所具功效的活性成分。國內外有學者對上述化學成分進行了含量測定［13-18］，對控制銀菊止癢洗液的質量有很好的指導意義。然而，中藥制劑的成分復雜多樣，銀菊止癢洗液在處方組成上與其他中藥制劑處方有很大差別，在控制其質量標準上不可簡單套用其他研究的檢測條件，通過測定銀菊止癢洗液中四種化學成分的含量，可以更好地控制和評價銀菊止癢洗液的內在質量。該研究建立了HPLC同時測定銀菊止癢洗液中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素四種化學成分含量的方法，為建立全面合理的銀菊止癢洗液控制和評價標準奠定了基礎。

1 儀器與試藥

U3000 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司），HH-S6 數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠），Synergy 超純水機（美國Millipore 公司），KQ-500GDV 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XS-205Du 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

銀菊洗劑來源于柳州市婦幼保健院，由野菊花、金銀花、蛇床子、地膚子、千里光、苦參、白鮮皮組成。對照品綠原酸（批號：110753-201716，純度：99.3%）、咖啡酸（批號：110885-200102，純度：100.0%）、蒙花苷（批號：111528-201308，純度：95.1%）、蛇床子素（批號：110822-201308，純度：100.0%）均為中國食品藥品檢定研究院標準物質和標準化管理中心提供。

水為超純水，甲醇、乙腈（美國Fisher 公司，色譜純），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸9.8 mg、咖啡酸10.5 mg、蒙花苷9.7 mg、蛇床子素10.9 mg，分別置于10 ml 容量瓶中，加甲醇超聲5 min（功率：500 W，頻率：40 kHz）使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各自單一對照品溶液。再分別精密量取上述單一對照品溶液各2.0 ml，置同一10 ml 量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成每1 ml 分別含綠原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備精密量取銀菊止癢洗液20.0 ml 于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次25 ml，棄去洗液，正丁醇萃取液水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，取續濾液過0.45 微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，30%A；10～30 min，30%A→50%A；30～35 min，50%A→70%A；35～40 min，70%A；40～41 min，70%～90%A；41～45 min，90%A；45～46 min，90%A→30%A；46～50 min，30%A），流速為1.0 ml/min，檢測波長為330 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為5 μl。采用外標法計算含量，理論塔板數以綠原酸計算應不低于5000，分離度大于1.5。

2.4 線性關系考察精密吸取“2.1”項單一對照品溶液各5 ml，置于25 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 ml 分別含綠原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的母液，從母液中分別精密量取0.5、1、2、3、5 和10 ml，分別置于10 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，分別進樣20 μl，以測得的相應信號（峰面積）對被測物質的量作圖，得到綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的回歸方程分別為：

Y=12.285X+0.1825 r=0.999 0

Y=11.566X+0.1853 r=0.999 0

Y=10.864X+0.0183 r=0.999 0

Y=11.937X+0.0174 r=0.999 0

線性范圍分別為1.96～39.2 μg、2.1～42.0 μg、1.94～38.8 μg、2.18～43.6 μg，X 表示樣品濃度，Y 表示該濃度下的峰面積。

2.5 精密度試驗精密量取銀菊止癢洗液20.0 ml于分液漏斗中，按“2.2 供試品溶液制備方法”制備，進樣5 μl，連續測定6 次，記錄峰面積。結果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積的RSD 分別為1.5%、0.05%、0.08%、0.25%；再取同一份銀菊止癢洗液供試品溶液，分別于溶液制備后1、2、3、4、5、6 d 同法進樣，記錄峰面積。結果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面積的RSD 分別為0.45%、0.58%、0.69%、0.27%，結果表明儀器在日內和日間精密度良好。

2.6 穩定性試驗取同一份銀菊止癢洗液供試品溶液，分別于溶液制備后0 h、2 h、4 h、12 h、24 h 進樣，測定，記錄各成分峰面積的RSD。結果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面積的RSD 分別為0.07%、0.56%、1.16%、2.07%（n=5），表明24 h 內供試品溶液穩定性良好。

圖1 混合對照品（A）和銀菊止癢洗液（B）HPLC 色譜圖

2.7 重復性試驗取同一批銀菊止癢洗液6 份，每份約20.0 ml，精密稱定，按“2.2 供試品制備方法”制備，分別進樣5 μl，記錄峰面積，并計算含量。綠原酸的平均含量為0.9625 mg/ml，RSD 為1.61%；咖啡酸0.5862 mg/ml，RSD 為0.63%；蒙花苷0.7153 mg/ml，RSD 為1.41%；蛇床子素0.5631 mg/ml，RSD 為1.93%，表明該方法重現性良好。

2.8 加樣回收率試驗精密稱定已測定含量（每1 ml中含綠原酸0.9572 mg；1 g 中含咖啡酸0.5560 mg；含蒙花苷0.7064 mg；含蛇床子素0.5436 mg），精密量取銀菊止癢洗液6 份，每份10 ml，另精密稱取對照品綠原酸47.86 mg、咖啡酸27.80 mg、蒙花苷35.32 mg、蛇床子素27.18 mg，置于100 ml 量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備液。分別在上述6 份藥材中精密加入混合對照品儲備液10 ml，按“2.2 供試品制備方法”制備，分別進樣5 μl，記錄綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積，計算含量，并計算回收率，結果見表1。

表1 銀菊止癢洗液中4 種化學成分的回收率試驗數據（n=6）

2.9 樣品含量測定精密量取6 批不同批號的銀菊止癢洗液，每份約20 ml，按“2.2”項方法制備供試品溶液，分別進樣5 μl 測定，記錄綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面積，并計算含量，結果見表2。

表2 銀菊止癢洗液中4 種化學成分的含量測定結果（mg/ml，n=4）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇該研究優選了不同提取條件制備供試品溶液，采用單因素變量法，考察了不同萃取溶劑（乙酸乙酯、正丁醇和乙醚溶液）、萃取用量（20、25、30 ml）、萃取次數（1、2、3、4 次）、除雜溶劑（乙醚、石油醚，正丁醇飽和水）對銀菊止癢洗液中四個化學成分提取率的影響。結果表明銀菊止癢洗液用水飽和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次25 ml，棄去洗液，四種目標成分提取效率明顯，且與其余成分分離明顯，可用于測定四個有效成分含量。

3.2 色譜條件的選擇綠原酸與蛇床子素極性相差較大，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫［19］、乙腈-水（65∶35）［20］發現蒙花苷和蛇床子素色譜峰的保留時間較長，且基線不平整。隨后改用甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，各成分出峰時間比較適中，且峰分離度較好，因此選擇甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液作流動相，進行梯度洗脫。

3.3 含量測定結果差異銀菊洗劑由野菊花、金銀花、蛇床子、地膚子、千里光、苦參、白鮮皮組成，分別由不同批號的中藥飲片組成，中藥飲片由于產地、種植等原因，其有效成分含量均有差異，導致不同批次的銀菊止癢洗劑中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素有所差異。

該實驗建立了HPLC 同時測定銀菊止癢洗液藥材中化學成分綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素含量的方法，并測定了6 批不同批次銀菊止癢洗液藥材中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素4 種化學成分的含量。建立含量的方法，操作簡便，分離度高，重復性好，結果準確，可作為銀菊止癢洗液含量測定方法，但是：不同批次銀菊止癢洗液藥材中四個化學成分的含量有一定差異性。提示采用多指標定量方法，能更好地控制銀菊止癢洗液藥材的內在指標。