多器官遠隔缺血時適應通過線粒體途徑對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響研究

張國明 丁立成 孫廣峰 留志賢 王斌 孫媛媛

（廈門大學附屬心血管病醫(yī)院 福建廈門361009）

近年來越來越多研究顯示，遠隔缺血時適應是一種可行的、安全的心臟保護措施，能夠改善預后[1]。遠隔缺血時適應主要是對遠隔臟器，如肢體循環(huán)進行短暫性缺血再灌注，使其產生一定的適應性，減輕心、腦等重要器官發(fā)生致命性缺血受損。已有研究證實，遠隔缺血時適應的作用機制主要是通過阻斷線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）開放，避免細胞受損來實現的[2]。但也有學者研究發(fā)現，遠隔缺血時適應選擇器官數量不同，其心臟保護作用可能存有差異[3]。本研究將進一步分析多器官遠隔缺血時適應對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并分析其與線粒體細胞凋亡途徑的關系。現報道如下：

1 材料和方法

1.1 實驗材料60只SD雄性大鼠，體質量180~250 g，自由飲食水，飼養(yǎng)室內溫濕度適宜，光線充足。Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε抗體來源于美國Sagma公司。

1.2 實驗分組 采用隨機數字表法將60只SD大鼠隨機分為假手術組、缺血/再灌注損傷對照組、標準機械后適應組、單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組六組，每組10只。

1.3 構建大鼠心肌缺血再灌注損傷模型 除了假手術組，其余組別建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，具體方法：經大鼠腹腔注射70 mg/kg 1%戊巴比妥鈉，待其睫毛反射消失、肌肉松弛時提示麻醉起效，將大鼠固定在解剖臺上。對頸部皮膚進行常規(guī)消毒，并將頸部皮膚縱向切口以使第二、第三氣管環(huán)顯露，進行氣管切開術，予以氣管插管和連接呼吸機，機械通氣參數設置：呼吸頻率65次/min，潮氣量2.5 ml/100 g，呼吸比1:1。然后在大鼠的右后肢、左側前后肢體置入心電圖電極以行心電圖監(jiān)測。與此同時，充分顯露大鼠的右頸總動脈，置入22G套管針，連接動脈壓力套裝連續(xù)測定大鼠頸動脈血壓。然后顯露右頸內靜脈，置入22G套管針將其與微量輸液泵相連接，用于補液或術中給藥。對大鼠的左側胸壁進行消毒，在胸骨左緣處沿胸骨方向剪開皮膚至第五肋間水平，再從胸骨旁水平向腋窩剪開皮膚，鈍性分離胸部肌肉并剪開至第四肋肋間肌。將心包膜撕開使心臟暴露，察看心臟前壁、左心耳形態(tài)結構。在心臟表面可察看到從心底部發(fā)出的左冠狀動脈前降支，用5-0縫合線從左心耳中點下緣左冠狀動脈前降支左側進針，右側出針，深度1 mm。然后在縫合線兩頭穿過長1 cm的連接管以免線頭滑落。經右頸總動脈注射少量肝素，預防血栓形成。將浸有肝素生理鹽水的1 mm棉絮放置在心肌表面和縫合線之間，以將左冠狀動脈前降支進行結扎。再向下推動連接管，將棉絮一起壓向左冠狀動脈前降支，并用血管鉗固定阻斷左冠狀動脈前降支血流實施缺血。松開血管鉗即可恢復左冠狀動脈前降支血流實施再灌注。

1.4 干預方法 建模成功24 h后實施干預。（1）假手術組：建模步驟參考上述心肌缺血再灌注損傷模型操作流程，但其分離左冠狀動脈和左側股動脈并穿線后不結扎，40 min后關閉大鼠胸腔。（2）缺血/再灌注損傷對照組：冠脈實施40 min缺血后即完全松開阻塞球囊恢復完全再灌注，分離左側股動脈并穿線后不結扎。（3）標準機械后適應組：冠脈實施40 min球囊阻塞缺血后，每隔30 s松開阻塞球囊30 s，共3次，至恢復完全再灌注；分離左側股動脈并穿線后不結扎。（4）單器官遠隔時適應組：冠脈實施40 min球囊阻塞缺血后即完全松開阻塞球囊恢復完全再灌注，分離左側股動脈并穿線，在冠脈結扎時結扎股動脈5min，而后再灌注5min，反復進行4個循環(huán)。（5）雙器官遠隔時適應組：處理同單器官遠隔時適應組，但其遠隔器官為雙側后肢。（6）三器官遠隔時適應組：處理同單器官遠隔時適應組，但其遠隔器官為雙側后肢和右側前肢。

1.5 觀察指標 （1）比較各組心肌細胞壞死率、線粒體腫脹程度。應用TUNEL法檢測心肌細胞壞死率，并應用電鏡觀察心肌組織線粒體的超微結構。（2）比 較 各 組 心 臟 組 織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達水平。實驗結束后，經大鼠右頸總動脈注射10%氯化鉀溶液2 ml將大鼠處死，取出心臟應用蛋白免疫印跡法進行檢測。

1.6 統計學方法 選用SPSS19.0統計學軟件分析數據，計量資料以（±s）描述，兩組對比經獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞壞死率比較 與缺血/再灌注損傷對照組相比，標準機械后適應組、單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組的心肌細胞壞死率顯著降低，且三器官遠隔時適應組的細胞壞死率最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細胞壞死率比較（%，±s）

表1 各組心肌細胞壞死率比較（%，±s）

注：與假手術組對比，*P＜0.05；與缺血/再灌注損傷對照組對比，#P＜0.05；與標準機械后適應組對比，&P＜0.05；與單器官遠隔時適應組對比，△P＜0.05；與雙器官遠隔時適應組對比，※P＜0.05。

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2.2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達水平比較 單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組大鼠心臟組織Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯低于缺血/再灌注損傷對照組、標準機械后適應組（P＜0.05），Cx43、PKC-ε蛋白表達明顯高于缺血/再灌注損傷對照組、標準機械后適應組（P＜0.05）；單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組上述基因蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達水平（±s）

表2 各組心臟組織Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達水平（±s）

注：與假手術組對比，*P＜0.05；與缺血/再灌注損傷對照組對比，#P＜0.05；與標準機械后適應組對比，&P＜0.05。

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3 討論

有研究顯示，遠隔缺血時適應的心肌保護機制與線粒體途徑作用有關，其能夠阻止mPTP開放，避免因mPTP開放而造成線粒體、心肌細胞受損，而且線粒體途徑還可以為短暫再灌注治療提供少量活性氧，進而通過激活線粒體ATO鉀離子通道而阻止mPTP開放，故其具有良好的心肌保護作用[4]。Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε為常見的線粒體調控因子。本研究結果顯示，單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組大鼠心臟組織的上述各項因子表達水平優(yōu)于缺血/再灌注損傷對照組、標準機械后適應組，進一步表明與標準后適應模式相比，遠隔缺血時適應模式能夠更好地發(fā)揮心肌保護作用，有效減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，這可能是通過調節(jié)線粒體細胞凋亡途徑來實現的。此外，本研究單器官遠隔時適應組、雙器官遠隔時適應組、三器官遠隔時適應組的Caspase-3、Bax、Cx43、PKC-ε蛋白表達值無明顯的差異，提示遠隔適應的器官數目與保護作用無明顯累加效應。