耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1在CRE中的流行病學分析及其機制研究*

陳丹丹 陳宏斌 吳敏校 邱杰 湯曉義 吳海英

（福建醫(yī)科大學附屬閩東醫(yī)院檢驗科 福安355000）

肺炎克雷伯桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，近年來該菌陽性率不斷增高，且耐藥率有逐年上升趨勢，甚至出現了耐碳氫酶烯類藥物的肺炎克雷伯桿菌。耐碳氫酶烯類藥物的腸桿菌科細菌，我們稱之為CRE（Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae），表現為多重耐藥。在醫(yī)院常見獲得性感染的革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)中肺炎克雷伯桿菌陽性率居前三，且出現了高毒力的肺炎克雷伯桿菌，易導致患者出現嚴重的內源性感染。在耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯桿菌中檢測出耐消毒劑基因，且攜帶率極高。耐消毒劑qacEΔl-sull基因極高的檢出率表明腸桿菌科細菌（肺炎克雷伯桿菌）對醫(yī)院常用消毒劑的抵抗性增高，且多出現在重癥監(jiān)護病房中，作為監(jiān)護重點，對消毒劑的規(guī)范使用監(jiān)督迫在眉睫，從而避免造成耐消毒劑基因在醫(yī)院局部流行。本研究觀察qacEΔl-sull基因在耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯桿菌中的流行情況，以期為醫(yī)院感染的有效控制提供指導。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2019年1月~2020年12月我院重癥監(jiān)護室住院患者的痰液標本或肺泡灌洗液，進行細菌培養(yǎng)和藥敏鑒定。

1.2 菌株鑒定 首先對標本進行細菌培養(yǎng)，挑選菌落進行鑒定，通過Vitek-2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)和藥敏系統(tǒng)對送檢標本進行檢測，選出對碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌，共選取15株菌株。質控菌株為肺炎克雷伯桿菌，標準菌株編號：ATCC700603，來自于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 聚合酶鏈反應（PCR）法檢測耐消毒劑基因qacEΔl-sull

1.3.1 細菌基因組DNA提取 用無菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)的單個陽性菌落（碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌），在1.5 ml的離心管內加入200 μl滅菌蒸餾水，放入挑取的菌株并振蕩混勻，混勻后80℃金屬浴10 min。金屬浴結束后，于室溫條件下，8 000 r/min高速離心10 min后棄掉沉淀物，取上清液即為模板，裝入EP管中于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qacEΔl-sull基因檢測 對耐消毒劑基因qacEΔl-sull應用PCR法檢測，PCR擴增產物大小為300 bp，引物，F：5'-TAGCGAGGGCTTTACCTAAG C-3'；R：5'-ATTCAGAAATGCCGAACACCG-3'[1]。50 μl的PCR反應體系包括10×PCR緩沖液1 μl，引物1和引物2各2 μl，dNTP為4 μl，Taq DNA聚合酶25 μl，DNA模板4 μl，加雙蒸水16 μl至50 μl。94℃預變性2 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.3.3 電泳 取擴增后的PCR產物5 μl于1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 基因測序 將擴增陽性的PCR產物片段低溫-20℃保存，寄至福州銳栢生物技術有限公司進行基因測序，并將陽性擴增基因測序結果在GenBank上進行BLAST比對。

2 結果

2.1 擴增產物電泳圖拍照 見圖1。

圖1 擴增產物電泳圖

2.2 基因測序結果 將qacEΔl-sul1擴增陽性產物的基因測序結果（見圖2）放至NCBI網站（http：//blast.Ncbi.nlm.Nih.gov/Blast.cgi）上進行比對。基因測序結果：CCGGGTTTATGGGCATCGCATTTTAT TTTCTTTCTCTGGTTCTGAAATCCATCCCTGTC GGTGTTGCTTATGCAGTCTGGTCGGGACTCGG CGTCGTCATAATTACAGCCATTGCCTGGTTGCT TCATGGGCAAAAGCTTGATGCGTGGGGCTTTG TAGGTATGGGGCTCATAATTGCTGCCTTTTTGC TCGCCCGATCCCCATCGTGGAAGTCGCTGCGG AGGCCGACGCCATGGTGACGGTGTTCGGCATT CTGAAT。15株耐碳氫酶烯肺炎克雷伯桿菌檢測出14株菌株攜帶有qacEΔl-sull基因，檢出率為93%（14/15）。

圖2 耐消毒劑基因qacE△1序列

3 討論

在重癥監(jiān)護病房分離出的肺炎克雷伯桿菌是造成醫(yī)院感染的主要細菌之一，可引起全身各系統(tǒng)的嚴重反應[2~3]。臨床數據表明，由于重癥監(jiān)護室病人大量使用碳青酶烯類藥物，乃至過度治療，在痰液中分離到的耐碳青酶烯類藥物肺炎克雷伯桿菌越來越多[4~5]。高毒力肺炎克雷伯菌，特別是耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌逐漸成為血液感染者和肝膿腫患者的主要病原菌[6]。耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌的毒力較強，不僅易出現醫(yī)院獲得性感染，而且容易導致年輕健康的個體獲病[7]，病人的死亡率高，并且引起很嚴重的內源性感染和并發(fā)癥。隨著多重耐藥菌的廣泛出現，消毒劑的使用在醫(yī)院感染管理中有著重要的地位。然而在消毒劑使用過程中，難免出現消毒劑濃度過高或消毒劑濫用的情況，勢必導致耐消毒劑基因菌株出現。當消毒劑使用過程中長期處于消毒時間或濃度不足，將會篩選出對消毒劑耐藥的細菌[8]。

在本研究中，選取重癥監(jiān)護病房中重癥患者的痰液或肺泡灌洗液中的耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯桿菌，參考相關文獻，設計耐消毒劑基因的引物，引物為F：5'-TAGCGAGGGCTTTACCTAAGC-3'；R：5'-ATTCAGAAATGCCGAACACCG-3'，PCR擴增后出現陽性產物，經基因測序比對后為qacEΔl-sull基因。15株耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯桿菌中有14株攜帶該基因，剩余1株未擴增出qacEΔl-sul1基因。陰性結果分析可能為這一株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯桿菌的qacEΔl-sul1基因突變或基因缺失，或者可能為實驗條件不合適所造成。

參考相關文獻，分析該菌耐消毒劑的原因[9~10]：細菌對消毒劑產生耐藥性的主要原因是選擇性壓力，尤其是在亞致死劑量消毒劑的使用下，或是在消毒劑濫用的情況下，細菌為適應不斷變化的消毒劑濃度環(huán)境，進而對消毒劑產生耐受。臨床上經常使用的消毒劑有碘伏、巴氏消毒液、533（含氯消毒劑）、愛護佳（含葡萄糖酸氯己定）、洗必泰、苯扎氯銨等。然而由于各種消毒劑在被廣泛而不盡合理地使用，從而對細菌造成選擇性壓力，產生對消毒劑不敏感或常規(guī)使用消毒劑濃度下不能殺滅細菌。因此我們在臨床消毒時，要不定期更換消毒劑，最大限度地降低細菌對消毒劑耐受。另外由于細菌長期暴露于日漸增高的消毒劑環(huán)境中，細菌對消毒劑的環(huán)境產生耐受。細菌耐消毒劑還有一個原因主要是qac基因家族表達多種化合物外排系統(tǒng)，細菌獲得qac基因后家族表達多種化合物外排泵，已發(fā)現的有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEΔ1，表現為對胍類化合物、季銨類、腙類化合物及堿性染料等的抗性[11]。耐消毒劑qacEΔ1基因編碼季銨鹽類、胍類化合物等消毒劑的外排蛋白，和sul1基因疊加，引起細菌對磺胺類抗生素的耐藥。由Ⅰ類整合子介導的qac基因家族中qacEΔ1基因，可被革蘭陰性菌（肺炎克雷伯桿菌）廣泛獲取[12~13]。

本研究收集的是重癥監(jiān)護室耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯桿菌，株數較少，只有15株，但耐消毒劑qacEΔl-sul1基因的攜帶率極高（93%）。此研究還有一定的局限性，未必能準確反映耐消毒劑qacEΔl-sul1基因的整體攜帶情況，但仍能反映出此類細菌對日常消毒劑的抗性。在某兒童醫(yī)院PICU[14]報告中，由于醫(yī)護人員手衛(wèi)生消毒不當和消毒劑不合理使用，導致耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯菌在PICU局部流行。耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的毒性強，對病人造成的危害大，特別是抵抗力弱，年齡低下或高齡的患者，帶來的危害最大。該菌不僅存在于重癥監(jiān)護病房，也存在于兒童或是其他不同病房，因此在治療其他病人時也需警惕該菌的出現，防止出現醫(yī)院的局部爆發(fā)流行，對病人造成不必要的危害。耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌不僅來自病人本身，還容易存活于醫(yī)院其他物體表面，例如醫(yī)護人員的手、工作服以及病人的周圍環(huán)境。因此我們在為病人使用抗生素治療的同時，必須注意該菌的消毒劑抗菌現象，防止多種耐藥菌群的交叉感染。根據細菌耐藥檢測報告，肺炎克雷伯桿菌的耐藥性在逐年遞增，對消毒劑的抗藥性也在逐年遞增，因此我們在合理規(guī)范使用抗生素的同時，應格外關注細菌對消毒劑產生的抗性現象，降低細菌對消毒劑的抗藥性，對醫(yī)院環(huán)境進行綜合治理。

綜上所述，細菌耐藥性的分布和傳播是受多方面因素影響和制約的，耐消毒劑基因的出現是不可避免的，也是不可預知的。臨床工作者要充分了解耐消毒劑基因的特征和現狀，建立健全的臨床消毒劑使用規(guī)范，減少因不規(guī)范使用或濫用消毒劑而導致的耐消毒劑基因的傳播。