EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子萌發和生長及重金屬吸收的影響

周紅艷，陳麗珊，黃艷清

(福建農業職業技術學院，福建 福州 350119)

根據2014年《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤重金屬污染形勢非常嚴峻，其中銅、鉛、鎘的超標率分別為1.5%、2.1%、7.0%。重金屬由于在環境中難以降解，而且對農作物生長和人類健康均有極大的危害[1]。環境中的鉛和銅是國家標準中嚴格控制的重金屬，因鉛、銅進入土壤后不易溶解、持久存在于環境中，可經生物鏈匯集在人體內，通過食物鏈對人體造成嚴重的危害。因此，對土壤中重金屬鉛和銅的去除已經成為刻不容緩的問題。目前，重金屬污染的修復主要采用植物修復、化學修復、微生物修復和綜合修復技術等。植物修復技術作為一項高效、經濟、無污染的土壤凈化技術越來越受到人們的重視，已成為環境科學領域的研究熱點[2-3]。但是，由于土壤環境中重金屬溶解度低、遷移性差及重金屬向植物地上部轉運效率不高等原因影響了植物的修復效果。而非生物螯合劑如EDTA是目前廣泛應用的一種螯合劑，能夠活化Pb、Cd、Zn、Cu等多種重金屬離子，促進植物對這些離子的超量吸收和富集，使植物修復重金屬污染技術的效果大大提高，其對Pb的活化效果最好[4]。

此外，微生物在自然界內種類繁多，并在重金屬元素的生物地球化學循環中扮演著重要的角色。目前，應用微生物聯合植物修復是土壤重金屬污染修復理論研究和應用實踐的新思路[5]。EM復合菌劑是由光合菌、酵母菌、乳酸菌等80多種厭氧性或好氧性微生物復合培養而成，自20世紀80年代初問世以來，EM技術已在60多個國家推廣和應用。施用EM可以達到對重金屬污染土壤進行微生物修復、降低重金屬含量、改善品質的目的[6]。而且由多種微生物共生而成的復合功能菌群，往往聚集了許多微生物的特征，對于一些結構非常復雜的污染物，其修復效果遠高于單一微生物，從而在污染環境修復中顯示出巨大的應用潛力[7]。Singh等[8]研究了復合菌群去除有害的微量金屬的效果，結果表明：該復合菌群去除了多達80%的Ni、Zn、Cu、Cd、Cr，以及接近45%的Pb。這些研究表明混合菌群能夠高效、全面地實現對重金屬復合污染環境的修復。

采用EDTA螯合劑與EM復合菌劑共同誘導植物修復重金屬污染是一個值得探討的研究領域，但迄今為止，利用EM復合菌劑與螯合劑EDTA的聯合施用，對重金屬鉛、銅復合污染下黑麥草修復效應方面的應用研究在國內鮮見報道。而且目前大部分是關于種子萌發、種子幼苗生長、發芽率等方面的研究，關于重金屬吸收情況的研究極少，采用水培方法可以全面分析在萌發階段重金屬的變化和幼苗生長、種子萌發之間的關系。另外，對于EDTA濃度在不同植物、不同生育期、不同重金屬環境脅迫下的使用濃度上存在較大的爭議。為此，筆者研究了EDTA螯合劑與EM復合菌劑對銅、鉛脅迫下黑麥草種子萌發、生長及重金屬銅、鉛吸收的影響，旨在為重金屬復合污染下采用多種方法聯合修復重金屬提供技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑麥草種子由千聚源種業公司提供；EM復合菌劑由江西天意生物技術有限公司提供；EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)由天津市化學試劑批發公司提供。

1.2 試驗設計

試驗前將黑麥草種子用0.2%次氯酸鈉消毒10 min，用蒸餾水反復沖洗數遍，浸種3 h后，挑選飽滿的種子，將水吸干放入直徑為9 cm的培養皿，皿內放相應大小的濾紙二層作為發芽床，每皿放入100粒種子。將配制好的EDTA、EM和硝酸鉛、硫酸銅溶液倒入培養皿，使得每個處理的Pb、Cu的最終濃度分別為200、250 μg/mL。每日采用稱重法加水至恒重，培養溫度為25 ℃，光照、黑暗周期分別為16、8 h。

試驗按兩因素完全隨機區組設計。設置6個處理，每個處理3次重復。EDTA和EM最終濃度如下。處理1：不加EDTA和EM，用水替代，保證鉛、銅濃度一致(CK)；處理2：EM 100倍液(EM 100)；處理3：EDTA 2.5 mmol/L(EDTA 2.5)；處理4：EDTA 2.5 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 2.5+EM 100)；處理5：EDTA 1.25 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 1.25+EM 100)；處理6：EDTA 6 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 6+EM 100)。

1.3 試驗方法

1.3.1 發芽和幼苗生長的統計方法 每天觀察生長情況，并按以下公式計算發芽率、發芽勢。

發芽率/%=(第10天正常發芽種子數/供試種子數)×100%

發芽勢/%=(第4天正常發芽種子數/供試種子數)×100%

第10天每皿隨機選取10株測量幼苗的根長、芽長，并取平均值；地上部鮮重，分別用剪刀取每株地上部稱重，每個處理3次重復。

1.3.2 重金屬Pb和Cu含量的測定方法

1.3.2.1 鉛標準曲線繪制 用硝酸鉛標準溶液10 μg/mL配制成濃度為0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 μg/mL的標準溶液，參照液體類樣品鉛含量檢測國標GB 5009.12─2017第三法火焰原子吸收法，用MIBK萃取鉛導入TAS-990F型原子吸收分光光度計(北京普析儀器公司)進行測定，按濃度與吸光度對應關系繪制標準曲線，曲線方程：A=0.0245C+0.0362(r=0.9998)。

1.3.2.2 銅標準曲線繪制 參照銅檢測國標GB 5009.13─2017第二法火焰原子吸收法，分別吸取0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL銅標準使用液(10.0 μg/mL)，分別置于50 mL容量瓶中，加5%硝酸稀釋至刻度，混勻。將樣液稀釋后和各容量瓶中銅標準液分別導入調至最佳條件的TAS-990F型原子吸收分光光度計測定，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到濃度與吸光度對應關系的曲線方程：A=0.1275C-0.0008(r=0.9996)。

1.3.2.3 樣品測定與儀器條件 試驗用水全為超純水，所使用玻璃器皿均用20% HNO3溶液浸泡24 h以上，然后用蒸餾水洗凈，晾干后使用。第10天每個培養皿吸取0.3 mL溶液與標準溶液相同方法檢測重金屬鉛的含量，銅測定液經稀釋后與標準溶液同樣條件進行測定。

原子吸收分光光度計測鉛儀器工作條件：燃氣組成為空氣-乙炔，檢測波長283.3 nm，光譜帶寬0.4 nm，燈電流2 mA，乙炔流量1200 mL/min，空氣流量8 L/min，燃燒器高度7.5 mm。

測銅儀器工作條件：燃氣組成為空氣-乙炔，檢測波長324.8 nm，光譜帶寬0.5 nm，燈電流8 mA，乙炔流量1600 mL/min，空氣流量9 L/min，燃燒器高度6 mm。

1.3.3 總酚、類黃酮含量的測定方法 取0.1000 g葉片，加入預冷的1% HCL甲醇溶液，然后于4 ℃浸提24 h，取浸提液經80%的甲醇稀釋后測定280 nm、325 nm處的OD值。總酚含量以沒食子酸標準曲線加以計算，類黃酮含量以OD325/g FW表示。

1.4 數據處理與分析

試驗所得數據用Excel 2016軟件進行整理，采用SPSS軟件，對芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率、總酚、類黃酮含量、重金屬銅、鉛含量進行方差分析和多重比較，P<0.01表示差異達極顯著水平，P<0.05表示差異達顯著水平。

2 結果與分析

2.1 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子萌發的影響

發芽勢和發芽率是反映種子活力非常重要的指標。由圖1可知，在銅、鉛復合污染脅迫下，不同濃度EM菌劑與EDTA處理對黑麥草種子發芽勢和發芽率的影響達顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。單獨使用EM菌劑(處理2)、EDTA(處理3)與CK相比，其發芽勢和發芽率都有明顯的提高。EM菌劑與EDTA配合使用時，3種處理組合濃度表現為EDTA 2.5+EM 100(處理4)>EDTA 1.25+EM 100(處理5)>EDTA 6+EM 100(處理6)。當處理組合濃度為EDTA 2.5+EM 100時，其發芽勢和發芽率均達到最高，比單獨使用EM菌劑、EDTA處理的都要高。而處理6與CK相比，其發芽勢和發芽率卻顯著下降，EDTA濃度達到6 mmol/L時表現出極大的抑制作用。由此可知，EM菌劑與EDTA合理的配合使用非常重要，可有效地促進重金屬銅、鉛脅迫下黑麥草種子的萌發。

圖1 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子發芽勢和發芽率的影響

2.2 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草幼苗生長的影響

2.2.1 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子芽長、根長的影響 由圖2可知，不同濃度EM菌劑與EDTA處理對黑麥草芽長和根長的影響大小都表現為處理4>處理3>處理5>處理2>處理1(CK)>處理6的變化趨勢。單獨使用EM菌劑、EDTA及其配合使用處理與對照(處理1)相比芽長和根長都有明顯的提高(處理6除外)。這表明在本試驗條件下，EDTA 2.5+EM 100處理組合是黑麥草幼苗生長的最佳濃度。處理4與處理5相比，適當提高EDTA濃度，有利于促進黑麥草的生長，芽長、根長分別為8.34、4.41 cm。但是當EDTA濃度達到6 mmol/L時，芽長、根長則極顯著下降，其中芽長、根長分別只有3.09、0.16 cm，表現出明顯的抑制作用，且對根的影響大于芽。

圖2 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草芽長和根長的影響

2.2.2 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子鮮重的影響 由圖3可以看出，EDTA 6+EM 100(處理6)對黑麥草的鮮重有抑制作用，且與對照差異極顯著。3個EDTA與EM配施處理對鮮重的影響大小表現為EDTA 2.5+EM 100(處理4)>EDTA 1.25+EM 100(處理5)>EDTA 6+EM 100(處理6)的變化趨勢。這表明適當增加EDTA濃度可以起到促進作用，但是濃度過高反而抑制黑麥草的生長。其中EDTA 2.5+EM 100處理在所有處理中鮮重達到最大值，與處理6相比，提高了6.2倍，與單獨使用的EDTA、EM處理的EDTA 2.5、EM 100相比，鮮重也都有不同程度的提高，說明兩者的合理配合使用對鮮重的影響產生了促進效應。

圖3 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草鮮重的影響

2.3 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草總酚、類黃酮含量的影響

酚類物質屬于具有防御功能的次生物質，能有效清除自由基，提高植物抗逆性。黃春輝等[9]研究指出獼猴桃抗氧化能力與總酚、類黃酮含量呈正相關。硝酸鹽脅迫下使用外源黃腐酸類黃酮和可溶性總酚含量增加，緩解對小白菜生長的抑制[10]。

本試驗結果表明，不同濃度EDTA與EM處理及其組合對黑麥草總酚、類黃酮含量的影響與對照相比都有不同程度的提高(處理6除外)。其中處理4達到了最高，這與前面幼苗生長和種子萌發表現出基本一致的變化趨勢。由此可見，該組合在一定程度上提高了黑麥草抗重金屬脅迫的能力，從而促進黑麥草的生長，而處理6中EDTA濃度過高則會產生較強的抑制作用，總酚、類黃酮含量積累也較低，這與前人的研究結論是一致的(表1)。

2.4 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下銅、鉛含量的影響

由表1可知，不同濃度EDTA與EM處理及其組合對黑麥草銅、鉛含量的影響達顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。處理2與處理1(CK)相比較，使用EM菌劑后銅、鉛含量都有不同程度的下降，這說明EM復合菌有利于對環境中重金屬的修復。

表1 EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草總酚、類黃酮、鉛、銅含量的影響

隨著EDTA濃度的提高，重金屬活化程度提高，結合其生長和種子萌發情況可以看出，EDTA濃度過高，對植物的毒性也隨之增大，從而導致植物生長和生物量下降。通過處理4與處理3對比可以看出，EDTA配合EM菌劑使用則使得重金屬濃度下降。

綜合上述，EDTA與EM合理的配合使用，表現出總酚和類黃酮的積累，提高了黑麥草抗重金屬脅迫的能力，從而促進了根系和地上部的生長，為重金屬污染的修復奠定了物質基礎。

3 討論

EM復合菌劑在農作物種植業、畜禽飼養業、水產養殖業、環保業等方面都有大量的應用和研究。其中EM應用于土壤重金屬修復也有相關報道。如劉瑞偉[11]研究了EM與有機肥對重金屬生物有效性，結果表明：施用EM可以達到對低濃度重金屬污染土壤進行微生物修復、降低重金屬含量、改善油菜品質的目的。采用EM原還能顯著改善小麥的長勢，提高產量和抗逆性[12]。鄭亞南等[13]研究了噴施堆肥復合微生物菌劑條件下草坪植物萌發及生長特性，結果表明：經葉面噴施適當濃度的復合堆肥微生物菌劑，能夠顯著促進草坪植物的萌發及生長。EM作為一種好氧和嫌氧型微生物制劑，它具有殺蟲、除臭、促進植物生長，提高產量和品質，增強抗逆性、降解農殘、有機肥無害化等多種功能。建議在茶樹上進一步試驗應用[14]。由此可知，EM對于重金屬修復和提高植物抗逆性都有一定的效果。

在本試驗條件下，使用EM菌劑可促進黑麥草芽長、根長增長，提高種子發芽率，與此同時，總酚和類黃酮等抗性物質明顯增加，從而減輕重金屬脅迫下黑麥草所受的傷害，提高黑麥草的抗逆性，促進根系和地上部分生物量的積累，從而為黑麥草有效吸收溶液中的重金屬奠定了物質基礎。大量的研究表明，植物的根系和地上生物量的積累是植物吸收重金屬的基礎[15-16]，這與前人的研究結果是一致的。

EDTA是一種高效的螯合劑，能夠有效活化土壤中的重金屬，提高植物對重金屬的富集量，因此被廣泛用于強化植物對土壤中重金屬的提取修復[17]，但在EDTA使用濃度上意見不一。張燦燦等[18]研究指出：5 mmol/kg EDTA促進高羊茅生長，濃度超過10 mmol/kg對植物生長產生抑制。廉菲等[19]研究EDTA對一年生黑麥草種子萌發及幼苗生長的影響，建議EDTA參考使用濃度為10 mmol/kg，濃度過高(20 mmol/kg、30 mmol/kg)則會對黑麥草的種子萌發產生極大的抑制作用。由于實際應用條件的不同，各文獻報道EDTA的使用濃度并不一致。本試驗研究結果表明：低濃度的EDTA能促進種子的萌發和幼苗生長，當EDTA濃度達到6 mmol/L則產生明顯的抑制。研究結論總體是相似的，這可能與不同植物處于不同的生長階段和環境條件等都有密切的關系。

4 結論

(1)EM菌劑對黑麥草的種子萌發、幼苗生長起促進作用，同時使得重金屬濃度下降，說明EM菌劑可用于環境中重金屬復合污染的修復。

(2)隨著EDTA濃度升高，重金屬活化程度提高，但是當濃度過高可能抑制黑麥草種子的萌發和幼苗生長，說明在實際應用中應根據實際情況確定EDTA濃度，不同文獻報道的推薦使用濃度并不一致，這可能與植物不同生長時期、環境中重金屬污染狀況等都有密切關系，因此需進一步深入探討。

(3)本試驗結果顯示，EM 100倍液+EDTA 2.5 mmol/L處理的效果最佳，與單獨施用EM、EDTA相比，對黑麥草生長和種子萌發都有促進作用，而當EDTA濃度達到6 mmol/L時則會產生明顯的抑制，因此植物幼苗生長階段建議EDTA濃度不超過6 mmol/L。

(4)現有的研究大多采用單一微生物進行重金屬修復，對于環境中重金屬復合污染下植物生長受到毒性的協同作用有極大的限制，故本試驗采用了EM復合菌作為供試微生物。另外，鑒于種子萌發階段幼苗的生物量小，有關EM菌劑與EDTA配施對黑麥草生長、重金屬修復的生理機制、重金屬的動態變化等有望進一步通過盆栽或田間試驗進行深入探討。包括EM復合菌中能修復重金屬有效菌的篩選及其功能特點的研究，以期在基礎領域取得更加廣闊的應用前景。