EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草種子萌發(fā)和生長及重金屬吸收的影響

周紅艷，陳麗珊，黃艷清

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350119)

根據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國土壤重金屬污染形勢非常嚴(yán)峻，其中銅、鉛、鎘的超標(biāo)率分別為1.5%、2.1%、7.0%。重金屬由于在環(huán)境中難以降解，而且對(duì)農(nóng)作物生長和人類健康均有極大的危害[1]。環(huán)境中的鉛和銅是國家標(biāo)準(zhǔn)中嚴(yán)格控制的重金屬，因鉛、銅進(jìn)入土壤后不易溶解、持久存在于環(huán)境中，可經(jīng)生物鏈匯集在人體內(nèi)，通過食物鏈對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害。因此，對(duì)土壤中重金屬鉛和銅的去除已經(jīng)成為刻不容緩的問題。目前，重金屬污染的修復(fù)主要采用植物修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、微生物修復(fù)和綜合修復(fù)技術(shù)等。植物修復(fù)技術(shù)作為一項(xiàng)高效、經(jīng)濟(jì)、無污染的土壤凈化技術(shù)越來越受到人們的重視，已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2-3]。但是，由于土壤環(huán)境中重金屬溶解度低、遷移性差及重金屬向植物地上部轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高等原因影響了植物的修復(fù)效果。而非生物螯合劑如EDTA是目前廣泛應(yīng)用的一種螯合劑，能夠活化Pb、Cd、Zn、Cu等多種重金屬離子，促進(jìn)植物對(duì)這些離子的超量吸收和富集，使植物修復(fù)重金屬污染技術(shù)的效果大大提高，其對(duì)Pb的活化效果最好[4]。

此外，微生物在自然界內(nèi)種類繁多，并在重金屬元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要的角色。目前，應(yīng)用微生物聯(lián)合植物修復(fù)是土壤重金屬污染修復(fù)理論研究和應(yīng)用實(shí)踐的新思路[5]。EM復(fù)合菌劑是由光合菌、酵母菌、乳酸菌等80多種厭氧性或好氧性微生物復(fù)合培養(yǎng)而成，自20世紀(jì)80年代初問世以來，EM技術(shù)已在60多個(gè)國家推廣和應(yīng)用。施用EM可以達(dá)到對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)、降低重金屬含量、改善品質(zhì)的目的[6]。而且由多種微生物共生而成的復(fù)合功能菌群，往往聚集了許多微生物的特征，對(duì)于一些結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的污染物，其修復(fù)效果遠(yuǎn)高于單一微生物，從而在污染環(huán)境修復(fù)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[7]。Singh等[8]研究了復(fù)合菌群去除有害的微量金屬的效果，結(jié)果表明：該復(fù)合菌群去除了多達(dá)80%的Ni、Zn、Cu、Cd、Cr，以及接近45%的Pb。這些研究表明混合菌群能夠高效、全面地實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬復(fù)合污染環(huán)境的修復(fù)。

采用EDTA螯合劑與EM復(fù)合菌劑共同誘導(dǎo)植物修復(fù)重金屬污染是一個(gè)值得探討的研究領(lǐng)域，但迄今為止，利用EM復(fù)合菌劑與螯合劑EDTA的聯(lián)合施用，對(duì)重金屬鉛、銅復(fù)合污染下黑麥草修復(fù)效應(yīng)方面的應(yīng)用研究在國內(nèi)鮮見報(bào)道。而且目前大部分是關(guān)于種子萌發(fā)、種子幼苗生長、發(fā)芽率等方面的研究，關(guān)于重金屬吸收情況的研究極少，采用水培方法可以全面分析在萌發(fā)階段重金屬的變化和幼苗生長、種子萌發(fā)之間的關(guān)系。另外，對(duì)于EDTA濃度在不同植物、不同生育期、不同重金屬環(huán)境脅迫下的使用濃度上存在較大的爭議。為此，筆者研究了EDTA螯合劑與EM復(fù)合菌劑對(duì)銅、鉛脅迫下黑麥草種子萌發(fā)、生長及重金屬銅、鉛吸收的影響，旨在為重金屬復(fù)合污染下采用多種方法聯(lián)合修復(fù)重金屬提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑麥草種子由千聚源種業(yè)公司提供；EM復(fù)合菌劑由江西天意生物技術(shù)有限公司提供；EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)由天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)前將黑麥草種子用0.2%次氯酸鈉消毒10 min，用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)遍，浸種3 h后，挑選飽滿的種子，將水吸干放入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿，皿內(nèi)放相應(yīng)大小的濾紙二層作為發(fā)芽床，每皿放入100粒種子。將配制好的EDTA、EM和硝酸鉛、硫酸銅溶液倒入培養(yǎng)皿，使得每個(gè)處理的Pb、Cu的最終濃度分別為200、250 μg/mL。每日采用稱重法加水至恒重，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照、黑暗周期分別為16、8 h。

試驗(yàn)按兩因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。設(shè)置6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。EDTA和EM最終濃度如下。處理1：不加EDTA和EM，用水替代，保證鉛、銅濃度一致(CK)；處理2：EM 100倍液(EM 100)；處理3：EDTA 2.5 mmol/L(EDTA 2.5)；處理4：EDTA 2.5 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 2.5+EM 100)；處理5：EDTA 1.25 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 1.25+EM 100)；處理6：EDTA 6 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 6+EM 100)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)芽和幼苗生長的統(tǒng)計(jì)方法 每天觀察生長情況，并按以下公式計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢。

發(fā)芽率/%=(第10天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽勢/%=(第4天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

第10天每皿隨機(jī)選取10株測量幼苗的根長、芽長，并取平均值；地上部鮮重，分別用剪刀取每株地上部稱重，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 重金屬Pb和Cu含量的測定方法

1.3.2.1 鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用硝酸鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μg/mL配制成濃度為0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照液體類樣品鉛含量檢測國標(biāo)GB 5009.12─2017第三法火焰原子吸收法，用MIBK萃取鉛導(dǎo)入TAS-990F型原子吸收分光光度計(jì)(北京普析儀器公司)進(jìn)行測定，按濃度與吸光度對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程：A=0.0245C+0.0362(r=0.9998)。

1.3.2.2 銅標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照銅檢測國標(biāo)GB 5009.13─2017第二法火焰原子吸收法，分別吸取0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL銅標(biāo)準(zhǔn)使用液(10.0 μg/mL)，分別置于50 mL容量瓶中，加5%硝酸稀釋至刻度，混勻。將樣液稀釋后和各容量瓶中銅標(biāo)準(zhǔn)液分別導(dǎo)入調(diào)至最佳條件的TAS-990F型原子吸收分光光度計(jì)測定，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到濃度與吸光度對(duì)應(yīng)關(guān)系的曲線方程：A=0.1275C-0.0008(r=0.9996)。

1.3.2.3 樣品測定與儀器條件 試驗(yàn)用水全為超純水，所使用玻璃器皿均用20% HNO3溶液浸泡24 h以上，然后用蒸餾水洗凈，晾干后使用。第10天每個(gè)培養(yǎng)皿吸取0.3 mL溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法檢測重金屬鉛的含量，銅測定液經(jīng)稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣條件進(jìn)行測定。

原子吸收分光光度計(jì)測鉛儀器工作條件：燃?xì)饨M成為空氣-乙炔，檢測波長283.3 nm，光譜帶寬0.4 nm，燈電流2 mA，乙炔流量1200 mL/min，空氣流量8 L/min，燃燒器高度7.5 mm。

測銅儀器工作條件：燃?xì)饨M成為空氣-乙炔，檢測波長324.8 nm，光譜帶寬0.5 nm，燈電流8 mA，乙炔流量1600 mL/min，空氣流量9 L/min，燃燒器高度6 mm。

1.3.3 總酚、類黃酮含量的測定方法 取0.1000 g葉片，加入預(yù)冷的1% HCL甲醇溶液，然后于4 ℃浸提24 h，取浸提液經(jīng)80%的甲醇稀釋后測定280 nm、325 nm處的OD值?？偡雍恳詻]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線加以計(jì)算，類黃酮含量以O(shè)D325/g FW表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行整理，采用SPSS軟件，對(duì)芽長、根長、鮮重、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、總酚、類黃酮含量、重金屬銅、鉛含量進(jìn)行方差分析和多重比較，P<0.01表示差異達(dá)極顯著水平，P<0.05表示差異達(dá)顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽勢和發(fā)芽率是反映種子活力非常重要的指標(biāo)。由圖1可知，在銅、鉛復(fù)合污染脅迫下，不同濃度EM菌劑與EDTA處理對(duì)黑麥草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。單獨(dú)使用EM菌劑(處理2)、EDTA(處理3)與CK相比，其發(fā)芽勢和發(fā)芽率都有明顯的提高。EM菌劑與EDTA配合使用時(shí)，3種處理組合濃度表現(xiàn)為EDTA 2.5+EM 100(處理4)>EDTA 1.25+EM 100(處理5)>EDTA 6+EM 100(處理6)。當(dāng)處理組合濃度為EDTA 2.5+EM 100時(shí)，其發(fā)芽勢和發(fā)芽率均達(dá)到最高，比單獨(dú)使用EM菌劑、EDTA處理的都要高。而處理6與CK相比，其發(fā)芽勢和發(fā)芽率卻顯著下降，EDTA濃度達(dá)到6 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出極大的抑制作用。由此可知，EM菌劑與EDTA合理的配合使用非常重要，可有效地促進(jìn)重金屬銅、鉛脅迫下黑麥草種子的萌發(fā)。

圖1 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

2.2 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草幼苗生長的影響

2.2.1 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草種子芽長、根長的影響 由圖2可知，不同濃度EM菌劑與EDTA處理對(duì)黑麥草芽長和根長的影響大小都表現(xiàn)為處理4>處理3>處理5>處理2>處理1(CK)>處理6的變化趨勢。單獨(dú)使用EM菌劑、EDTA及其配合使用處理與對(duì)照(處理1)相比芽長和根長都有明顯的提高(處理6除外)。這表明在本試驗(yàn)條件下，EDTA 2.5+EM 100處理組合是黑麥草幼苗生長的最佳濃度。處理4與處理5相比，適當(dāng)提高EDTA濃度，有利于促進(jìn)黑麥草的生長，芽長、根長分別為8.34、4.41 cm。但是當(dāng)EDTA濃度達(dá)到6 mmol/L時(shí)，芽長、根長則極顯著下降，其中芽長、根長分別只有3.09、0.16 cm，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且對(duì)根的影響大于芽。

圖2 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草芽長和根長的影響

2.2.2 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草種子鮮重的影響 由圖3可以看出，EDTA 6+EM 100(處理6)對(duì)黑麥草的鮮重有抑制作用，且與對(duì)照差異極顯著。3個(gè)EDTA與EM配施處理對(duì)鮮重的影響大小表現(xiàn)為EDTA 2.5+EM 100(處理4)>EDTA 1.25+EM 100(處理5)>EDTA 6+EM 100(處理6)的變化趨勢。這表明適當(dāng)增加EDTA濃度可以起到促進(jìn)作用，但是濃度過高反而抑制黑麥草的生長。其中EDTA 2.5+EM 100處理在所有處理中鮮重達(dá)到最大值，與處理6相比，提高了6.2倍，與單獨(dú)使用的EDTA、EM處理的EDTA 2.5、EM 100相比，鮮重也都有不同程度的提高，說明兩者的合理配合使用對(duì)鮮重的影響產(chǎn)生了促進(jìn)效應(yīng)。

圖3 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草鮮重的影響

2.3 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草總酚、類黃酮含量的影響

酚類物質(zhì)屬于具有防御功能的次生物質(zhì)，能有效清除自由基，提高植物抗逆性。黃春輝等[9]研究指出獼猴桃抗氧化能力與總酚、類黃酮含量呈正相關(guān)。硝酸鹽脅迫下使用外源黃腐酸類黃酮和可溶性總酚含量增加，緩解對(duì)小白菜生長的抑制[10]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度EDTA與EM處理及其組合對(duì)黑麥草總酚、類黃酮含量的影響與對(duì)照相比都有不同程度的提高(處理6除外)。其中處理4達(dá)到了最高，這與前面幼苗生長和種子萌發(fā)表現(xiàn)出基本一致的變化趨勢。由此可見，該組合在一定程度上提高了黑麥草抗重金屬脅迫的能力，從而促進(jìn)黑麥草的生長，而處理6中EDTA濃度過高則會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，總酚、類黃酮含量積累也較低，這與前人的研究結(jié)論是一致的(表1)。

2.4 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下銅、鉛含量的影響

由表1可知，不同濃度EDTA與EM處理及其組合對(duì)黑麥草銅、鉛含量的影響達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。處理2與處理1(CK)相比較，使用EM菌劑后銅、鉛含量都有不同程度的下降，這說明EM復(fù)合菌有利于對(duì)環(huán)境中重金屬的修復(fù)。

表1 EM菌劑與EDTA配施對(duì)銅、鉛復(fù)合污染下黑麥草總酚、類黃酮、鉛、銅含量的影響

隨著EDTA濃度的提高，重金屬活化程度提高，結(jié)合其生長和種子萌發(fā)情況可以看出，EDTA濃度過高，對(duì)植物的毒性也隨之增大，從而導(dǎo)致植物生長和生物量下降。通過處理4與處理3對(duì)比可以看出，EDTA配合EM菌劑使用則使得重金屬濃度下降。

綜合上述，EDTA與EM合理的配合使用，表現(xiàn)出總酚和類黃酮的積累，提高了黑麥草抗重金屬脅迫的能力，從而促進(jìn)了根系和地上部的生長，為重金屬污染的修復(fù)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

EM復(fù)合菌劑在農(nóng)作物種植業(yè)、畜禽飼養(yǎng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)保業(yè)等方面都有大量的應(yīng)用和研究。其中EM應(yīng)用于土壤重金屬修復(fù)也有相關(guān)報(bào)道。如劉瑞偉[11]研究了EM與有機(jī)肥對(duì)重金屬生物有效性，結(jié)果表明：施用EM可以達(dá)到對(duì)低濃度重金屬污染土壤進(jìn)行微生物修復(fù)、降低重金屬含量、改善油菜品質(zhì)的目的。采用EM原還能顯著改善小麥的長勢，提高產(chǎn)量和抗逆性[12]。鄭亞南等[13]研究了噴施堆肥復(fù)合微生物菌劑條件下草坪植物萌發(fā)及生長特性，結(jié)果表明：經(jīng)葉面噴施適當(dāng)濃度的復(fù)合堆肥微生物菌劑，能夠顯著促進(jìn)草坪植物的萌發(fā)及生長。EM作為一種好氧和嫌氧型微生物制劑，它具有殺蟲、除臭、促進(jìn)植物生長，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，增強(qiáng)抗逆性、降解農(nóng)殘、有機(jī)肥無害化等多種功能。建議在茶樹上進(jìn)一步試驗(yàn)應(yīng)用[14]。由此可知，EM對(duì)于重金屬修復(fù)和提高植物抗逆性都有一定的效果。

在本試驗(yàn)條件下，使用EM菌劑可促進(jìn)黑麥草芽長、根長增長，提高種子發(fā)芽率，與此同時(shí)，總酚和類黃酮等抗性物質(zhì)明顯增加，從而減輕重金屬脅迫下黑麥草所受的傷害，提高黑麥草的抗逆性，促進(jìn)根系和地上部分生物量的積累，從而為黑麥草有效吸收溶液中的重金屬奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。大量的研究表明，植物的根系和地上生物量的積累是植物吸收重金屬的基礎(chǔ)[15-16]，這與前人的研究結(jié)果是一致的。

EDTA是一種高效的螯合劑，能夠有效活化土壤中的重金屬，提高植物對(duì)重金屬的富集量，因此被廣泛用于強(qiáng)化植物對(duì)土壤中重金屬的提取修復(fù)[17]，但在EDTA使用濃度上意見不一。張燦燦等[18]研究指出：5 mmol/kg EDTA促進(jìn)高羊茅生長，濃度超過10 mmol/kg對(duì)植物生長產(chǎn)生抑制。廉菲等[19]研究EDTA對(duì)一年生黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，建議EDTA參考使用濃度為10 mmol/kg，濃度過高(20 mmol/kg、30 mmol/kg)則會(huì)對(duì)黑麥草的種子萌發(fā)產(chǎn)生極大的抑制作用。由于實(shí)際應(yīng)用條件的不同，各文獻(xiàn)報(bào)道EDTA的使用濃度并不一致。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：低濃度的EDTA能促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗生長，當(dāng)EDTA濃度達(dá)到6 mmol/L則產(chǎn)生明顯的抑制。研究結(jié)論總體是相似的，這可能與不同植物處于不同的生長階段和環(huán)境條件等都有密切的關(guān)系。

4 結(jié)論

(1)EM菌劑對(duì)黑麥草的種子萌發(fā)、幼苗生長起促進(jìn)作用，同時(shí)使得重金屬濃度下降，說明EM菌劑可用于環(huán)境中重金屬復(fù)合污染的修復(fù)。

(2)隨著EDTA濃度升高，重金屬活化程度提高，但是當(dāng)濃度過高可能抑制黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗生長，說明在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定EDTA濃度，不同文獻(xiàn)報(bào)道的推薦使用濃度并不一致，這可能與植物不同生長時(shí)期、環(huán)境中重金屬污染狀況等都有密切關(guān)系，因此需進(jìn)一步深入探討。

(3)本試驗(yàn)結(jié)果顯示，EM 100倍液+EDTA 2.5 mmol/L處理的效果最佳，與單獨(dú)施用EM、EDTA相比，對(duì)黑麥草生長和種子萌發(fā)都有促進(jìn)作用，而當(dāng)EDTA濃度達(dá)到6 mmol/L時(shí)則會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制，因此植物幼苗生長階段建議EDTA濃度不超過6 mmol/L。

(4)現(xiàn)有的研究大多采用單一微生物進(jìn)行重金屬修復(fù)，對(duì)于環(huán)境中重金屬復(fù)合污染下植物生長受到毒性的協(xié)同作用有極大的限制，故本試驗(yàn)采用了EM復(fù)合菌作為供試微生物。另外，鑒于種子萌發(fā)階段幼苗的生物量小，有關(guān)EM菌劑與EDTA配施對(duì)黑麥草生長、重金屬修復(fù)的生理機(jī)制、重金屬的動(dòng)態(tài)變化等有望進(jìn)一步通過盆栽或田間試驗(yàn)進(jìn)行深入探討。包括EM復(fù)合菌中能修復(fù)重金屬有效菌的篩選及其功能特點(diǎn)的研究，以期在基礎(chǔ)領(lǐng)域取得更加廣闊的應(yīng)用前景。