苦瓜枯萎病病原的鑒定與防治藥劑篩選

關 峰,張景云,石 博,萬新建,黃長林

(江西省農業科學院 蔬菜花卉研究所,江西 南昌 330200)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)為葫蘆科苦瓜屬(Momordica)蔓性植物,起源于熱帶亞熱帶地區,廣泛分布于南美亞馬遜地區、非洲、亞洲等地[1]。苦瓜因碧玉剔透、口感爽脆且營養豐富而深受大眾的喜愛。但苦瓜連作導致種植土壤環境惡化,連作障礙日益嚴重,土傳病害發生隨之加重。苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(FusariumoxysporumSchl.f.sp.momordicae)引起的一種典型的真菌土傳病害[2],在中國各苦瓜種植區均有發生,可造成苦瓜干枯萎蔫,最后導致全株死亡[3]。江西樂平作為苦瓜生產的重要基地,近幾年來苦瓜種植面積逐年擴大,但該市位于長江以南,其雨水較多、高溫高濕的氣候條件適于苦瓜枯萎病的發生和流行,導致部分種植大戶年損失在10萬元以上。在苦瓜生產上,枯萎病一般發病率為15%～25%,在連作障礙嚴重的地塊發病率可達60%,當此病流行時田間出現大量的枯黃死株,最終導致苦瓜的產量降低,從而造成嚴重的經濟損失[4]。

迄今為止,尚未發現對苦瓜枯萎病免疫的苦瓜品種。采用化學藥劑仍然是防治苦瓜枯萎病最有效的手段[5]。目前,在苦瓜生產上主要使用的化學藥劑有異菌脲、甲基硫菌靈、噁霉靈、五氯硝基苯、多菌靈、百菌清、戊唑醇等。由于苦瓜枯萎病菌生長快、適宜度高,連續使用同一種化學藥劑極易使該病菌對農藥產生抗藥性[6、7]。苦瓜枯萎病的病原菌鑒定對抗性品種篩選與創制、藥劑防治及生物防治策略的制定等多方面均有重要價值。為了進一步探明樂平市苦瓜枯萎病的病原菌以及化學藥劑對其的抑制作用,本研究從江西省樂平市苦瓜主產區采集苦瓜枯萎病病株樣本,對其致病菌進行了分離、純化、鑒定、致病力檢測及ITS序列分析,并針對生產上常用的7種化學藥劑開展了篩選試驗,以期為制定苦瓜枯萎病防控新策略,以及指導苦瓜生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于2017、2018、2019年從江西省樂平市袁綠種養專業合作社苦瓜種植大棚內共采集發病植株72株,用報紙包裹后及時帶回實驗室。

1.2 供試殺菌劑及來源

供試殺菌劑的名稱及來源詳見表1。

表1 供試殺菌劑的名稱及來源

1.3 病原菌的分離、鑒定

取苦瓜發病植株的莖基部,清洗去泥,切去兩端,先用0.1%升汞消毒30 s,再用75%酒精消毒30 s,共進行3次；隨后用無菌水洗滌3～4次,再用滅菌濾紙吸干植株莖基部組織表面的水分,最后將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基上在28 ℃條件下培養；待長出菌絲后,挑取部分菌餅接種在PDA平板上；經3次純化后,采用稀釋法進行單孢分離和培養,在顯微鏡條件下進行形態特征描述。將致病菌再次回接于苦瓜幼苗，對發病苦瓜幼苗進行病原物的再分離,與原接種菌株比較,進行Koch’s法則驗證。

1.4 致病菌的rDNA-ITS序列分析

采用CTAB法[8]進行菌體基因組DNA的提取。用真菌rDNA的通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。采用MEGA version 4.0進行系統發育分析；采用鄰位相連法(neighbor-joining, NJ)進行進化距離分析；系統樹的檢驗用Bootstrap 1000次重復。將菌株的rDNA-ITS序列在GenBank核酸數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行BLASTN比對。

1.5 致病性測定

取在培養基上生長旺盛的枯萎病菌菌餅邊緣，接種于液體培養基中,并置于26 ℃恒溫搖床內震蕩培養3～5 d。待菌絲長出后,用雙層紗布過濾，去掉菌絲。用血球計數器計算病菌孢子的濃度并調至1×106cfu/L。采用浸移法進行苦瓜枯萎病菌的回接試驗；對照組采用無菌水進行處理；待枯萎病發生后,再次從發病幼苗的莖基部分離病原菌,觀察分離菌株與原接種菌株在形態上的差別。

1.6 室內毒力試驗

采用生長速率抑制法[9，10],將供試的7種化學藥劑各配制成一定質量濃度的母液,再根據各藥劑說明書推薦的濃度設置中間濃度,配制成系列質量濃度的各種藥液：40%五氯硝基苯、50%異菌脲、50%多菌靈(120、60、30、15、7.5 mg/L)；25%戊唑醇(200、100、50、25、12.5 mg/L)；75%百菌清、70%甲基硫菌靈(116、58、29、14.5、7.25 mg/L)；99%噁霉靈(12、6、3、1.5、0.75 mg/L)。最后制作含有不同質量濃度各種藥液的培養基平板。每個處理3次重復。在接種后,將培養皿置于28 ℃培養箱中培養7 d，然后采用十字交叉法測量各化學藥劑濃度處理的菌落直徑,計算各化學藥劑濃度處理對菌絲生長的抑制率。取濃度的對數值,將生長抑制率轉換成幾率值,建立毒力回歸方程,并計算各化學藥劑的有效抑制中濃度(EC50)和相關系數。抑制率(%)的計算公式為：抑制率=[(對照組菌落直徑-菌餅直徑)-(處理組菌落直徑-菌餅直徑)]/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.7 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2017和DPS 7.05軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 苦瓜枯萎病菌的鑒定結果

對采集的病樣進行分離純化，得到5個菌株(編號LP1、LP3、LP4、LP8、LP10)。用肉眼觀察這些菌株的菌落和形態學特征，沒有發現明顯差異；菌絲濃密絮狀,呈地毯狀平鋪,菌落圓形,白色或淡紫色(圖1)。在顯微鏡下，其分生孢子呈鐮刀狀,3～5隔。依據Booth’s鐮刀菌分類鑒定標準初步鑒定這些菌株為尖孢鐮刀菌。選擇代表性菌株LP1進行Koch’s準則的驗證。根據測序結果,將序列在GenBank數據庫中進行同源序列搜索。根據真菌的分子分類原則[11],發現其與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)序列的相似度較高,同源性達到99%(圖2),因此初步鑒定從苦瓜病株中分離出的病原菌均為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

圖1 江西省樂平市苦瓜枯萎病菌的形態特征

圖2 LP1菌株的系統發育樹

2.2 致病性鑒定

將本試驗分離的病原菌采用傷根法接種無病苦瓜幼苗,苦瓜幼苗于接種后7 d開始出現子葉萎蔫下垂或葉脈黃化等癥狀,11 d后幼苗葉片發黃、卷曲、變脆,植株逐漸枯萎,15 d后基部無新增發病植株。在樂平的潮濕天氣下,后期常能看到苦瓜藤蔓莖基部出現紅褐色縱裂,切開病株莖基部可發現其維管束變成褐色(圖B1、圖B2)。對照苦瓜植株無發病癥狀,生長發育正常(圖A1、圖A2)。

從表2可以看出：在接種后，菌株LP1、LP3、LP4的致病性較強；菌株LP9和LP10的致病性較弱。

表2 不同菌株接種后苦瓜的發病結果統計

2.3 不同殺菌劑對枯萎病菌菌絲生長的影響

不同殺菌劑對苦瓜枯萎病菌的抑菌作用測定結果(表3)表明,7種殺菌劑對尖孢鐮刀菌苦瓜專化型的抑制效果差異明顯,在一定的質量濃度范圍內,隨著質量濃度的增加,藥劑的抑菌效果呈現明顯增強的趨勢,除50%異菌脲外,其余6種殺菌劑在最高濃度下的抑制率均達到了50%。

表3 7種殺菌劑對苦瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

由表4可見：99%噁霉靈對苦瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制活性最強,有效抑制中濃度EC50值為0.0352 mg/L;50%多菌靈和25%戊唑醇次之, EC50值分別為0.3037和8.2324 mg/L;75%百菌清、70%甲基硫菌靈、40%五氯硝基苯的EC50值分別為31.3541、64.5849、71.0890 mg/L;50%異菌脲的抑菌效果最差, EC50值為419.0041 mg/L。

表4 7種藥劑對苦瓜枯萎病菌的室內毒力測定結果

A:健康的苦瓜植株和葉片(對照)。B:感病的苦瓜植株和葉片。

3 結論與討論

枯萎病是嚴重影響苦瓜產量和品質的一種較難防控的土傳病害,近幾年苦瓜種植戶深受其害,尤其是在多年種植苦瓜的老菜地。樂平市苦瓜種植面積已有660 hm2以上,是當地重要的經濟蔬菜品種,苦瓜枯萎病已嚴重影響到蔬菜種植大戶的經濟效益。因此,確定苦瓜枯萎病的致病菌種類,對癥下藥篩選防治藥劑對田間防治苦瓜枯萎病具有重要意義。根據樂平市苦瓜病樣的組織分離結果,結合rDNA-ITS序列分析,對苦瓜枯萎病的病原菌進行形態學和分子生物學鑒定，結果表明,本研究所分離的病原菌為尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(FusariumoxysporumSchl.f.sp.momordicae)。

在苦瓜生產中，由于不了解致病菌和殺菌劑的特性,種植戶往往盲目用藥,造成大量浪費且防治效果降低,并且影響生態環境[12]。因此,需開展苦瓜病害的合理防治研究。本文采用菌絲生長速率法,篩選市場上常見且低毒的7種化學農藥對苦瓜枯萎病致病菌進行室內毒力測定,其中99%噁霉靈具有顯著的抑制作用,其EC50值為0.0352 mg/L,因此該殺菌劑是田間防治苦瓜枯萎病的較為理想的農藥。噁霉靈屬于內吸性殺菌劑,可用于土壤殺菌與種子消毒,可以促進作物生長[13]。50%多菌靈也具有較好的抑菌作用。在苦瓜生產上建議多種農藥交替使用,避免產生抗藥性。